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liukgg

木虫 (小有名气)

[求助] SDS-PAGE

最近做谷氨酸棒杆菌诱导蛋白的蛋白电泳，不知道什么原因跑出来的结果没有条带，我是跑的全菌体，加上loading buffer后100℃金属浴5/10分钟（做了两次，一次五分钟，一次十分钟），上样20µl，浓缩胶跑的电压是90v，分离胶是120v，跑出来的结果是MAEKER正常，其他泳道什么都没有。自己一块跑的纯化的蛋白没有问题（一块制的胶）。诱导后的发酵液取100µl后离心能都看到挺多的菌体沉淀，第一次遇见这种情况，请大家帮忙分析一下原因。谢谢
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山水凤凰
1楼 2011-09-02 21:55:30
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一毫升的枪

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

话说你的全菌体是怎么取的？
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2楼2011-09-03 05:38:14
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hnzhaolongfei
3楼2011-09-03 07:02:35
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liukgg

木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 一毫升的枪 at 2011-09-03 05:38:14:
话说你的全菌体是怎么取的？

就是取诱导后的发酵液直接离心得到全菌体
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山水凤凰
4楼2011-09-03 10:24:30
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塞外雨

金虫 (著名写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-09-03 17:12:27
跑的全菌体，加上loading buffer后100℃金属浴5/10分钟
这样能把菌体完全裂解吗？超声试试。你的金属浴温度到了１００度，ＥＰ管内的菌体受到温度还是比这个低的。
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

liukgg
只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
5楼2011-09-03 17:02:20
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liukgg

木虫 (小有名气)
★ ★ ★
送鲜花一朵
dhd997(金币+3): good 2011-09-04 09:48:52
引用回帖:
5楼: Originally posted by 塞外雨 at 2011-09-03 17:02:20:
跑的全菌体，加上loading buffer后100℃金属浴5/10分钟
这样能把菌体完全裂解吗？超声试试。你的金属浴温度到了１００度，ＥＰ管内的菌体受到温度还是比这个低的。

以前做大肠杆菌的诱导时这样完全没有问题，不知道这次是怎么回事。今天超声试过了，跑完电泳能看到条带，但是特别的淡，而没有超声的还是什么也看不到，开来问题肯定是出在菌体破碎上了，重新诱导试一下吧
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山水凤凰
6楼2011-09-03 21:16:23
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beckham_zxsy

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

liukgg(金币+1): 谢谢回帖 2011-09-04 01:22:19
离心收获菌体收到的量大吗？是不是摇菌有问题啊
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7楼2011-09-03 23:24:21
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liukgg

木虫 (小有名气)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励热心交流 2011-09-04 09:49:05
引用回帖:
7楼: Originally posted by beckham_zxsy at 2011-09-03 23:24:21:
离心收获菌体收到的量大吗？是不是摇菌有问题啊

挺大的，因为诱导的时间长一些，所以比一般的大肠杆菌诱导完后得到的菌体要多，明天再试一次看看吧，第一次做谷棒的菌
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山水凤凰
8楼2011-09-04 01:21:56
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塞外雨

金虫 (著名写手)
★
西瓜(金币+1): 鼓励交流 2011-09-04 18:54:35
引用回帖:
6楼: Originally posted by liukgg at 2011-09-03 21:16:23:
以前做大肠杆菌的诱导时这样完全没有问题，不知道这次是怎么回事。今天超声试过了，跑完电泳能看到条带，但是特别的淡，而没有超声的还是什么也看不到，开来问题肯定是出在菌体破碎上了，重新诱导试一下吧

破碎时可以做镜检，破碎前后看看菌还有多少。
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只想找到关心我、在我犹豫时能给我判断的人
9楼2011-09-04 10:30:20
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liukgg

木虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 塞外雨 at 2011-09-04 10:30:20:
破碎时可以做镜检，破碎前后看看菌还有多少。

恩，下次试一下吧，3Q
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山水凤凰
10楼2011-09-04 13:17:06
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