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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达蛋白纯化
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)

[求助] 原核表达蛋白纯化 已有2人参与

我用的是pet-30a表达载体，Nde1和BamH1两个酶切位点，目的条带200多bp，我用iptg诱导，28摄氏度，结果表达量很低，求高手指点
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学术狗
1楼 2013-11-14 11:13:15
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2013-11-14 18:35:35
用pet-30a表达载体，Nde1和BamH1两个酶切位点，N端和C端都没有His-tag，只能用常规的离子交换、输水层析等方法分离。
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3楼2013-11-14 13:55:45
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lllilei1986

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2013-11-14 18:35:49
应该看看你蛋白沉淀表达量如何，如以包涵体为主，建议换载体，32a或者42a，前边带有融合标签，会增加可溶性，
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6楼2013-11-14 16:04:59
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2013-11-14 18:35:22
如果你的问题是表达量低，先优化下诱导条件。优化后再考虑过柱纯化的问题。
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2楼2013-11-14 13:26:07
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待您更多精彩。 2013-11-14 18:36:02
试试18度下，0.1mM IPTG 过夜表达
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行至水穷处，坐看云起时
8楼2013-11-14 18:23:22
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zh10246

铁杆木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-11-14 22:46:50
优化条件，做好对照，确认表达了，表达低，多培养点细菌
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9楼2013-11-14 19:20:19
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傻傻的——

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-11-14 23:21:21
换个载体试试吧  可能会有改善
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12楼2013-11-14 20:34:02
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by 最美的平凡 at 2013-11-14 15:59:01
我试过几个条件，感觉表达量都不说很高的，纠结...

是表达量低还是形成包涵体了？如果是包涵体的话，减缓诱导速度（降低IPTG浓度，降低温度等）会有些帮助。
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13楼2013-11-15 07:36:08
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wanghx_2012

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
表达量低，看是什么宿主，提高表达量不但是诱导剂（IPTG）的浓度，还有培养条件，添加IPTG的时间，不行还可以换诱导剂，或则增加质粒拷贝数等方法，你在看看
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最美的平凡
16楼2013-11-15 10:28:39
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wuyao0513

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-11-15 16:13:05
先高温诱导看看是不是能高效表达，确定可以高效表达后再做条件优化，还有你表达的蛋白是不是包涵体，我以前用的就是pet-30  结果表达基本全是包涵体。之后换成了pet-32的就可溶了！！
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19楼2013-11-15 15:02:39
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 最美的平凡 at 2013-11-15 09:20:31
应该是表达量低，因为超声破碎菌体之后，离心之后很少沉淀啊...

总表达量可以直接把诱导的菌离心，用SDS-PAGE上样buffer重悬，离心后跑胶。
第二步是确定诱导出的蛋白是形成了包涵体还是可溶形式表达。如果没有形成包涵体，超声破碎后离心蛋白应该在上清里面，沉淀是未破碎的菌体和包涵体。你需要对上清和沉淀的蛋白样品都跑胶。
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21楼2013-11-16 03:39:11
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 91candy at 2015-05-04 15:52:10
过夜表达的意思是大约10小时吗？...

当时我没有试过这个，后来换了一个表达载体，表达量竟然出奇的高
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学术狗
27楼2015-05-05 11:09:19
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普通回帖

最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-11-14 13:55:45
用pet-30a表达载体，Nde1和BamH1两个酶切位点，N端和C端都没有His-tag，只能用常规的离子交换、输水层析等方法分离。

我的N端有6个His
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学术狗
4楼2013-11-14 15:58:04
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-11-14 13:26:07
如果你的问题是表达量低，先优化下诱导条件。优化后再考虑过柱纯化的问题。

我试过几个条件，感觉表达量都不说很高的，纠结
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学术狗
5楼2013-11-14 15:59:01
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lllilei1986 at 2013-11-14 16:04:59
应该看看你蛋白沉淀表达量如何，如以包涵体为主，建议换载体，32a或者42a，前边带有融合标签，会增加可溶性，

我超声菌体之后，离心，沉淀很少的，估计不是这个原因吧，不过你的建议我可以试试，谢谢啦！
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学术狗
7楼2013-11-14 16:20:19
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zh10246 at 2013-11-14 19:20:19
优化条件，做好对照，确认表达了，表达低，多培养点细菌

好的，谢谢
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学术狗
10楼2013-11-14 19:44:17
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