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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达菌液裂解
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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 原核表达菌液裂解

原核表达时取取500微升菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用50微升灭菌水重悬后加50微升2×上样buffer，然后100℃煮沸5min，12000rpm离心1min，然后取上清，20微升装一管，可是当我吸到最后的时候没有看到有沉淀啊？因为上样buffer颜色太深了，沉淀也不是特别容易观察，我想请问大家做的时候都能看到沉淀吗？
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1楼 2011-08-26 18:19:03
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★
friya0910(金币+1): 2011-08-27 12:37:54
friya0910(金币+1): 2011-08-28 14:40:36
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-08-28 16:56:29
如果你是BL21(DE3)，可以取1-2ml，最后溶解到50-100vl loading buf中，然后上样，其实看你的胶的分辨率；这个比较常规，没有什么神奇的；DE3有几条特征带，要注意你的蛋白质大小不要“碰巧”和他们一样大！呵呵
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12楼2011-08-27 11:37:34
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longage.gene

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-27 10:09:24:
如果看全菌蛋白的话不都是用的煮沸法么？不过我用默克表达手册上计算上样量的方法计算出来我最多的上样量要达到80多微升呢！

80多微升！那你的胶看样子不小啊！
看蛋白要煮沸，但煮沸前得让蛋白溶于液体，你直接拿菌去煮，蛋白能全出来吗？谁懂得介绍一下。
蛋白煮沸是为了让蛋白构想变化，成线形状，不然有构象的话跑胶看不出大小的。我这样认为的，也有可能有错。
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13楼2011-08-28 11:33:23
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普通回帖

friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-26 18:19:03:
原核表达时取取500微升菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用50微升灭菌水重悬后加50微升2×上样buffer，然后100℃煮沸5min，12000rpm离心1min，然后取上清，20微升装一管，可是当我吸到最后的时候没有看到有沉淀啊 ...

还在诱导中……是我离心时间太短还是煮沸时间太短啊？在线等高手指点！
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2楼2011-08-26 18:19:47
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pipi1106

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
friya0910(金币+1):谢谢参与
friya0910(金币+1): 2011-08-26 19:02:58
dhd997(金币+3): 2011-08-27 09:25:41
不知道你是用的什么原核表达系统，是胞内还是胞外表达。
以前我们实验室用大肠杆菌表达提取蛋白的时候会用超声波破碎后离心收集。
具体有没有蛋白你跑个SDS-PAGE电泳不就知道了嘛~~
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3楼2011-08-26 19:01:09
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pipi1106 at 2011-08-26 19:01:09:
不知道你是用的什么原核表达系统，是胞内还是胞外表达。
以前我们实验室用大肠杆菌表达提取蛋白的时候会用超声波破碎后离心收集。
具体有没有蛋白你跑个SDS-PAGE电泳不就知道了嘛~~

用大肠杆菌表达的，煮沸法是看总蛋白的，看别人都说煮沸后离心取上清上样，可是为什么我的离心后没有沉淀呢？煮沸前还有菌体的呀？跑哪去了？会不会是加了甘油就离不下来了啊？费解……有没有人知道蛋白上样缓冲液中各成分的具体作用啊？
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4楼2011-08-26 19:09:50
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pipi1106

银虫 (正式写手)
★ ★ ★
amisking(金币+3): 鼓励应助 2011-08-26 20:03:30
friya0910(金币+2): 2011-08-26 22:16:18
嗯，我们以前的顺序是先离心收集大肠杆菌---加裂解液超声破碎---离心收集---加上样液煮沸5min-10min。一般来讲是会有少许沉淀的，即使没破碎也应该会有白色沉淀的，大肠杆菌跑哪儿去了？离心1min时间太短了，可以适当加长时间，速度提到13000rpm也没问题啊~~希望对你有用！
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5楼2011-08-26 19:26:00
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by pipi1106 at 2011-08-26 19:26:00:
嗯，我们以前的顺序是先离心收集大肠杆菌---加裂解液超声破碎---离心收集---加上样液煮沸5min-10min。一般来讲是会有少许沉淀的，即使没破碎也应该会有白色沉淀的，大肠杆菌跑哪儿去了？离心1min时间太短了，可以 ...

谢谢，我后来把离心时间提高到了5min，还是没瞅见，就这么着吧，跑完电泳就知道有没有处理好了！
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6楼2011-08-26 22:17:15
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
friya0910(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): good 2011-08-27 09:25:54
friya0910(金币+1): 2011-08-27 10:04:48
你这个可能是你的菌体较少，而且loading buf颜色较深，不过长时间离心应该是有沉淀的，至少有细胞碎片

走个胶看看吧，没有那么神奇的，最低还有细胞的蛋白质呢
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7楼2011-08-26 23:22:26
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longage.gene

银虫 (小有名气)
★
friya0910(金币+1):谢谢参与
可能我学习不够。我觉得你这个方法只靠煮沸有点。。。。不知结果如何，没猜错的话你跑出来的样应该很稀很稀
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8楼2011-08-27 09:27:08
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longage.gene

银虫 (小有名气)
friya0910(金币+1): 2011-08-27 10:06:45
可能我学习不够。我觉得你这个方法只靠煮沸有点。。。。不知结果如何，没猜错的话你跑出来的样应该很稀很稀
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9楼2011-08-27 09:28:28
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by quiller2000 at 2011-08-26 23:22:26:
你这个可能是你的菌体较少，而且loading buf颜色较深，不过长时间离心应该是有沉淀的，至少有细胞碎片

走个胶看看吧，没有那么神奇的，最低还有细胞的蛋白质呢

这个菌体量也是网上查的，我看还有人取300微升菌液的呢！那一般要取多少啊？由于我第一次做，实验室也没会做的人，老师也不懂，所以这些小细节都不知道要怎么处理，没经验啊！
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10楼2011-08-27 10:06:27
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by longage.gene at 2011-08-27 09:28:28:
可能我学习不够。我觉得你这个方法只靠煮沸有点。。。。不知结果如何，没猜错的话你跑出来的样应该很稀很稀

如果看全菌蛋白的话不都是用的煮沸法么？不过我用默克表达手册上计算上样量的方法计算出来我最多的上样量要达到80多微升呢！
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11楼2011-08-27 10:09:24
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ghost202

铜虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
我也碰到这个情况，不要紧的，吸掉上清，沉淀加1*loading buffer即可，可以跑出带来的
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14楼2011-10-21 21:08:05
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wxq999

新虫 (小有名气)
西瓜:编辑内容 2011-10-24 17:20
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[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-24 at 17:20 ]
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15楼2011-10-24 17:18:45
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