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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达菌液裂解
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friya0910

新虫 (正式写手)

[交流] 原核表达菌液裂解

原核表达时取取500微升菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用50微升灭菌水重悬后加50微升2×上样buffer，然后100℃煮沸5min，12000rpm离心1min，然后取上清，20微升装一管，可是当我吸到最后的时候没有看到有沉淀啊？因为上样buffer颜色太深了，沉淀也不是特别容易观察，我想请问大家做的时候都能看到沉淀吗？
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1楼 2011-08-26 18:19:03
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quiller2000

木虫 (著名写手)
★ ★
friya0910(金币+1): 2011-08-27 12:37:54
friya0910(金币+1): 2011-08-28 14:40:36
西瓜(金币+2): 鼓励交流 2011-08-28 16:56:29
如果你是BL21(DE3)，可以取1-2ml，最后溶解到50-100vl loading buf中，然后上样，其实看你的胶的分辨率；这个比较常规，没有什么神奇的；DE3有几条特征带，要注意你的蛋白质大小不要“碰巧”和他们一样大！呵呵
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12楼2011-08-27 11:37:34
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
1楼: Originally posted by friya0910 at 2011-08-26 18:19:03:
原核表达时取取500微升菌液，12000rpm离心1min，弃上清，用50微升灭菌水重悬后加50微升2×上样buffer，然后100℃煮沸5min，12000rpm离心1min，然后取上清，20微升装一管，可是当我吸到最后的时候没有看到有沉淀啊 ...

还在诱导中……是我离心时间太短还是煮沸时间太短啊？在线等高手指点！
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2楼2011-08-26 18:19:47
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pipi1106

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
friya0910(金币+1):谢谢参与
friya0910(金币+1): 2011-08-26 19:02:58
dhd997(金币+3): 2011-08-27 09:25:41
不知道你是用的什么原核表达系统，是胞内还是胞外表达。
以前我们实验室用大肠杆菌表达提取蛋白的时候会用超声波破碎后离心收集。
具体有没有蛋白你跑个SDS-PAGE电泳不就知道了嘛~~
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3楼2011-08-26 19:01:09
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friya0910

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pipi1106 at 2011-08-26 19:01:09:
不知道你是用的什么原核表达系统，是胞内还是胞外表达。
以前我们实验室用大肠杆菌表达提取蛋白的时候会用超声波破碎后离心收集。
具体有没有蛋白你跑个SDS-PAGE电泳不就知道了嘛~~

用大肠杆菌表达的，煮沸法是看总蛋白的，看别人都说煮沸后离心取上清上样，可是为什么我的离心后没有沉淀呢？煮沸前还有菌体的呀？跑哪去了？会不会是加了甘油就离不下来了啊？费解……有没有人知道蛋白上样缓冲液中各成分的具体作用啊？
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4楼2011-08-26 19:09:50
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