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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达蛋白纯化
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 最美的平凡 at 2013-11-15 09:20:31
应该是表达量低，因为超声破碎菌体之后，离心之后很少沉淀啊...

总表达量可以直接把诱导的菌离心，用SDS-PAGE上样buffer重悬，离心后跑胶。
第二步是确定诱导出的蛋白是形成了包涵体还是可溶形式表达。如果没有形成包涵体，超声破碎后离心蛋白应该在上清里面，沉淀是未破碎的菌体和包涵体。你需要对上清和沉淀的蛋白样品都跑胶。
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21楼2013-11-16 03:39:11
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wanghx_2012

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 最美的平凡 at 2013-11-15 14:50:18
嗯，谢谢，不过，我还想问下，怎么增加质粒拷贝数啊？...

选择第一次的转化子再次转化，或则选择高拷贝数的载体
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22楼2013-11-18 08:26:01
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
你好，请教个问题：1.表达载体应该怎么选择尼？后期是要用纯化目的蛋白做抗体的，pET-22，pET-28，pET-30，我应该怎么选择尼？他们各自有什么优缺点？
2.需要做融合表达的，N-端表达和C-端表达各有什么优缺点？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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23楼2014-04-30 20:16:29
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lihuahan

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lxj341401 at 2013-11-14 13:55:45
用pet-30a表达载体，Nde1和BamH1两个酶切位点，N端和C端都没有His-tag，只能用常规的离子交换、输水层析等方法分离。

你好，请问怎么使N段或者C端与His融合表达？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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24楼2014-04-30 20:24:03
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salanero2000

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

表达量低很多因素导致吧，只能慢慢探索了。不过不知道你做的同样条件其他是否都是表达正常的。先找体系问题再找个体差异。
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25楼2014-08-07 10:16:21
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91candy

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by pennchem at 2013-11-14 18:23:22
试试18度下，0.1mM IPTG 过夜表达

过夜表达的意思是大约10小时吗？
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26楼2015-05-04 15:52:10
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
26楼: Originally posted by 91candy at 2015-05-04 15:52:10
过夜表达的意思是大约10小时吗？...

当时我没有试过这个，后来换了一个表达载体，表达量竟然出奇的高
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学术狗
27楼2015-05-05 11:09:19
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91candy

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
27楼: Originally posted by 最美的平凡 at 2015-05-05 11:09:19
当时我没有试过这个，后来换了一个表达载体，表达量竟然出奇的高...

你用的神马？
最近在做全市金的transB，根本不生长，会是抗生素加多了吗？
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28楼2015-05-05 13:12:47
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 91candy at 2015-05-05 13:12:47
你用的神马？
最近在做全市金的transB，根本不生长，会是抗生素加多了吗？...

我当时也是用的全式金的Transetta，一直都不错。你是说转化完了菌没长出来？还是摇菌的时候菌长不起来？
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学术狗
29楼2015-05-05 20:26:19
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最美的平凡

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
28楼: Originally posted by 91candy at 2015-05-05 13:12:47
你用的神马？
最近在做全市金的transB，根本不生长，会是抗生素加多了吗？...

正常情况下，不生长是不正常的，有可能是抗生素加多了，也有可能是表达感受态过期了啊
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学术狗
30楼2015-05-05 20:27:35
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