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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 蛋白原核表达和包涵体纯化问题
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zbblpp

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白原核表达和包涵体纯化问题 已有2人参与

大家好，最近在原核表达两个蛋白，一个是153AA，一个是166AA，均有信号肽，用salI和NotI酶切位点克隆进PET28A载体中，30度诱导4h, 153AA的大表有表达，大概是20KD，表达量小，估计3%，166AA的大表没有表达。

用含溶菌酶的裂解液裂解（没有超声裂解）后，发现二者主要都是包涵体表达，因为上清中很少蛋白，用8M尿素变性（变性时由于用的是1.5ml离心管做的小样，没有超声处理，所以也是溶解一部分），之后取变性的样品上清和沉淀SDS-PAGE电泳，发现二者分子量一样是14KD，很奇怪的现象,难道是提前终止了么？还是因为变性不充分，蛋白没有完全展开，但是也不至于分子量是一样，并且偏小这么多吧？大家遇到过这样的问题么？谢谢！

对于这个现象，把诱导前的菌做了PCR鉴定，相互之间是没有污染的，并且166AA的克隆是送测序过的，所以克隆构建也没有问题。
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1楼 2014-08-03 17:01:30
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zbblpp

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 凌波丽 at 2014-08-05 10:31:03
给你个包涵体纯化、变性和复性的实验流程吧，具体你的问题改日再讨论，今天我没有时间了。

谢谢您！
有虫友认为可能是跑胶的样品加了β-巯基乙醇，还原剂把二硫键打开了。我这两天做了验证，发现不是这个原因。153AA的有3个CYS, 其中前两个形成二硫键时有活性，但第三个也容易和前两个错配，可能就引发没有活性。我现在想如果错配的话，分子量也不至于偏小这么多吧。

不知道信号肽会不会把蛋白折断，但是折断后也应该有15.5KD的。

您的流程很有帮助，再次感谢
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6楼2014-08-06 15:45:13
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查看全部 9 个回答

zbblpp

新虫 (初入文坛)
没人帮忙，自己顶一下
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2楼2014-08-05 10:07:24
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+3, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-08-06 09:06:10
zbblpp: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢 2014-08-06 15:40:06
给你个包涵体纯化、变性和复性的实验流程吧，具体你的问题改日再讨论，今天我没有时间了。
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  • 附件 1 : Purificationofinclusionbodiesandrefoldingofproteins.pdf
    • 2014-08-05 10:38:08, 93.73 K
3楼2014-08-05 10:31:03
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nlbtr

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
youlinglyw: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，生物科学有你更精彩！ 2014-08-06 09:06:18
拒绝包涵体，你可以选择真核蛋白表达
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4楼2014-08-05 16:18:52
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