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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 层析/纯化 » 关于包涵体复性百分之80%全部沉淀，求指教。
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落满夏天

银虫 (正式写手)

[交流] 关于包涵体复性百分之80%全部沉淀，求指教。

小弟在做包涵体复性时，开始是用6M盐酸胍溶解，后经镍柱螯合后换成8M尿素缓冲液，后面复性时问题就来了，变性蛋白只要离开8M尿素就开始沉淀，做过阶段透析就是先从8M过渡到4M，再到2M或者直接到TRIS-HCL，PH8.5缓冲液里，蛋白大部分沉淀，想请教关于这种不稳定蛋白应如何选择体系，之前试过加0.02%吐温80，和5%甘油，PEG，GLY无论是稀释还是透析，结果均不理想大量沉淀，收率过低。该蛋白正确复性后其水溶性较好，不知道什么原因包涵体如此不稳定。如果用其他表面活性剂后面可能难以进行纯化。不知道如何是好？请高手指教。如果用盐酸胍复性是不是能好些？
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1楼 2014-02-17 20:47:29
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
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137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-02-18 08:25:18
请参考Frangioni等，好像是199x年的论文，Analytical Chemistry
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2楼2014-02-18 06:25:34
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
沉淀是在什么阶段发生的？为什么一开始不用8M Urea 直接变性上柱呢？盐浓度是多少呢？
建议你做一下8M到6M的透析，看看还是不是一样沉淀？同时在换成非Urea缓冲系统时候在缓冲液中提高盐浓度。
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3楼2014-02-18 16:01:10
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落满夏天

银虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by dshlove at 2014-02-18 16:01:10
沉淀是在什么阶段发生的？为什么一开始不用8M Urea 直接变性上柱呢？盐浓度是多少呢？
建议你做一下8M到6M的透析，看看还是不是一样沉淀？同时在换成非Urea缓冲系统时候在缓冲液中提高盐浓度。

离开8M尿素就会产生沉淀，原来想用尿素变性，但是效果不是很好，会有沉淀，这个包涵体很不稳定。最后盐浓度也就是tris-hcl浓度到多少合适？20NM？
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4楼2014-02-19 12:07:25
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dshlove

木虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 落满夏天 at 2014-02-19 12:07:25
离开8M尿素就会产生沉淀，原来想用尿素变性，但是效果不是很好，会有沉淀，这个包涵体很不稳定。最后盐浓度也就是tris-hcl浓度到多少合适？20NM？...

就是你从8M开始透析成tris缓冲液的盐浓度。你可以配成1M的NaCL试试。
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5楼2014-02-19 12:36:11
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极道始之魔

银虫 (小有名气)
★
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我最近也在做包涵体复性的实验，不知道这个复兴率有多少，不可能百分百的，所以我的透析完后，还是会出现少量的沉淀。整体看上去有点极淡蓝色的感觉，不知道是不是可溶的就是复性成功的。另外，做得是一个融合蛋白，也不知道酶切融合蛋白产生的目的蛋白就是复性好的。另外，发现在目的蛋白下面多出了1条带，不知道是降解了还是怎么的，一般蛋白不会降解的，是不是复性成功的蛋白和没复性成功的蛋白会跑出来不一样的条带
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6楼2014-02-19 14:08:56
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