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落满夏天

银虫 (正式写手)

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[交流] 关于包涵体复性百分之80%全部沉淀，求指教。

小弟在做包涵体复性时，开始是用6M盐酸胍溶解，后经镍柱螯合后换成8M尿素缓冲液，后面复性时问题就来了，变性蛋白只要离开8M尿素就开始沉淀，做过阶段透析就是先从8M过渡到4M，再到2M或者直接到TRIS-HCL，PH8.5缓冲液里，蛋白大部分沉淀，想请教关于这种不稳定蛋白应如何选择体系，之前试过加0.02%吐温80，和5%甘油，PEG，GLY无论是稀释还是透析，结果均不理想大量沉淀，收率过低。该蛋白正确复性后其水溶性较好，不知道什么原因包涵体如此不稳定。如果用其他表面活性剂后面可能难以进行纯化。不知道如何是好？请高手指教。如果用盐酸胍复性是不是能好些？

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1楼 2014-02-17 20:47:29

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落满夏天

银虫 (正式写手)

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引用回帖:

3楼: Originally posted by dshlove at 2014-02-18 16:01:10
沉淀是在什么阶段发生的？为什么一开始不用8M Urea 直接变性上柱呢？盐浓度是多少呢？
建议你做一下8M到6M的透析，看看还是不是一样沉淀？同时在换成非Urea缓冲系统时候在缓冲液中提高盐浓度。

离开8M尿素就会产生沉淀，原来想用尿素变性，但是效果不是很好，会有沉淀，这个包涵体很不稳定。最后盐浓度也就是tris-hcl浓度到多少合适？20NM？