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落满夏天

银虫 (正式写手)


[交流] 关于包涵体复性百分之80%全部沉淀,求指教。

小弟在做包涵体复性时,开始是用6M盐酸胍溶解,后经镍柱螯合后换成8M尿素缓冲液,后面复性时问题就来了,变性蛋白只要离开8M尿素就开始沉淀,做过阶段透析就是先从8M过渡到4M,再到2M或者直接到TRIS-HCL,PH8.5缓冲液里,蛋白大部分沉淀,想请教关于这种不稳定蛋白应如何选择体系,之前试过加0.02%吐温80,和5%甘油,PEG,GLY无论是稀释还是透析,结果均不理想大量沉淀,收率过低。该蛋白正确复性后其水溶性较好,不知道什么原因包涵体如此不稳定。如果用其他表面活性剂后面可能难以进行纯化。不知道如何是好?请高手指教。如果用盐酸胍复性是不是能好些?
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dshlove

木虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
4楼: Originally posted by 落满夏天 at 2014-02-19 12:07:25
离开8M尿素就会产生沉淀,原来想用尿素变性,但是效果不是很好,会有沉淀,这个包涵体很不稳定。最后盐浓度也就是tris-hcl浓度到多少合适?20NM?...

就是你从8M开始透析成tris缓冲液的盐浓度。你可以配成1M的NaCL试试。
5楼2014-02-19 12:36:11
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exon2002

铁杆木虫 (著名写手)


★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
137167741: 金币+1, 鼓励交流~~ 2014-02-18 08:25:18
请参考Frangioni等,好像是199x年的论文,Analytical Chemistry
2楼2014-02-18 06:25:34
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dshlove

木虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
沉淀是在什么阶段发生的?为什么一开始不用8M Urea 直接变性上柱呢?盐浓度是多少呢?
建议你做一下8M到6M的透析,看看还是不是一样沉淀?同时在换成非Urea缓冲系统时候在缓冲液中提高盐浓度。
3楼2014-02-18 16:01:10
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落满夏天

银虫 (正式写手)


引用回帖:
3楼: Originally posted by dshlove at 2014-02-18 16:01:10
沉淀是在什么阶段发生的?为什么一开始不用8M Urea 直接变性上柱呢?盐浓度是多少呢?
建议你做一下8M到6M的透析,看看还是不是一样沉淀?同时在换成非Urea缓冲系统时候在缓冲液中提高盐浓度。

离开8M尿素就会产生沉淀,原来想用尿素变性,但是效果不是很好,会有沉淀,这个包涵体很不稳定。最后盐浓度也就是tris-hcl浓度到多少合适?20NM?
4楼2014-02-19 12:07:25
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