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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体构建，测序不成功
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芥末猫

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达载体构建，测序不成功

郁闷死了，构建原核表达载体，提质粒电泳检测是大于两千，又用目的基因的引物做pcr检测，条带正确，然后送测序，告诉我可能是空载。。。。。。。
要是空载的话我pcr还能有目的条带吗？这个构建了好久了，一直没成功，快疯了
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1楼2012-06-05 18:49:02
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回帖置顶 ( 共有1个 )

merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极热心应助 2012-09-07 13:39:14
引用回帖:
12楼: Originally posted by 547star at 2012-06-06 11:33:31
如果重新连接有困难,就拿质粒再转化,挑几个单菌落培养,保藏,提质粒跑电泳看是否跟预期大小相似,是的话,拿一个质粒或保藏的菌种送测序....

同意11楼的建议，从测序峰图来看，是信号杂，可能的原因是质粒浓度低。如果是用您PCR扩增引物进行测序的话，还可能存在引物不适合测序的情况。此外，如果您的质粒存在复杂结构，或者是GCrich等特殊情况，那么测序也有可能存在信号杂。
补充上述11楼的建议：质粒重转化后，挑单克隆取5-6ml的菌液隔夜培养后，离心后弃去上清液，将沉淀后的菌体送测序，由测序公司直接抽提质粒后进行测序（即沉菌直抽），这样容易抽提到浓度较好的质粒，从而提高测序的成功率。

此外，当挑取的克隆样品为空载与带有插入片段的重组子的混合克隆时，用特异引物PCR进行鉴定，引物有可以结合的模板，产物以指数级进行增长，所以您在电泳时是可以看到特异条带的，但测序是用单条引物进行线性扩增，当模板量很少时，产物会更少，当进行荧光检测时，很有可能被当做背景峰或在峰图中完全不能够体现。还有含有少量重组子的混合克隆，在经过再次培养时空载体的增值速度大于重组子从而导致重组子的衰亡，在测序结果中显示空载。
解决办法是：在进行菌落PCR鉴定时，可采用一侧为载体上的通用引物，一侧为您的特异性引物进行鉴定，当条带单一且与您的目的片段长度一致则可以说明片段连接是成功的，如出现多条带，长度不符或无条带等情况，则说明连入片段可能有误。
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17楼2012-09-07 09:58:13
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普通回帖

芥末猫

银虫 (小有名气)
这里还有张测序失败的图片，懂的给看看吧，谢谢啊
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2楼2012-06-05 18:55:49
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504775490

金虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-06 13:46:35
这张测序图谱确实不怎么好，按楼主的说法应该是构建成功了，你可以送个菌液给公司，或者是换一家公司。我前几天也送质粒去测序了，也说有两个样测序失败，不过这个公司给返工重测了，结果测出来了，也有可能是公司的问题！我是跟诺塞测的序，他家服务不错，仅供参考！
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3楼2012-06-05 20:41:23
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lanjb1013

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果，经常构建的话，建议你用载体的通用引物检测。
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4楼2012-06-05 23:27:36
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caoluoyuan

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做过对照吗？空载能否扩增出条带？
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5楼2012-06-06 08:09:30
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-06 13:46:44
PCR真不好说的，影响因素太多，出来带不一定就是。测序峰套叠的多了点，但是也能看出每个位置有一个峰高很多。这种情况，我一般认为是质粒不纯或出现非特异性，可能是菌不纯或质粒提取被污染，建议划线纯化，直接挑菌送测序。
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为什么
6楼2012-06-06 08:54:42
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l68266152

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
有可能是污染了戴空载质粒的菌，也有可能是背景的条带
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相信自己
7楼2012-06-06 08:58:59
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2012-06-06 08:54:42
PCR真不好说的，影响因素太多，出来带不一定就是。测序峰套叠的多了点，但是也能看出每个位置有一个峰高很多。这种情况，我一般认为是质粒不纯或出现非特异性，可能是菌不纯或质粒提取被污染，建议划线纯化，直接挑 ...

你好，你的意思是用我提的质粒转化大肠杆菌划线吗？
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8楼2012-06-06 10:03:07
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 504775490 at 2012-06-05 20:41:23
这张测序图谱确实不怎么好，按楼主的说法应该是构建成功了，你可以送个菌液给公司，或者是换一家公司。我前几天也送质粒去测序了，也说有两个样测序失败，不过这个公司给返工重测了，结果测出来了，也有可能是公司的 ...

那个，我的菌液没有了。。。。质粒也就一点了。。。
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9楼2012-06-06 10:05:21
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-06-06 18:39:44
信号太差了，测序相当不准确，如果PCR检测是阳性的，你可以把PCR回收，连接载体转化测序
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10楼2012-06-06 10:45:14
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