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原核表达载体构建，测序不成功
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郁闷死了，构建原核表达载体，提质粒电泳检测是大于两千，又用目的基因的引物做pcr检测，条带正确，然后送测序，告诉我可能是空载。。。。。。。 要是空载的话我pcr还能有目的条带吗？这个构建了好久了，一直没成功，快疯了 |
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 【分子生物】EPI帖 | 测序相关问题 |
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极热心应助 2012-09-07 13:39:14
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极热心应助 2012-09-07 13:39:14
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同意11楼的建议，从测序峰图来看，是信号杂，可能的原因是质粒浓度低。如果是用您PCR扩增引物进行测序的话，还可能存在引物不适合测序的情况。此外，如果您的质粒存在复杂结构，或者是GCrich等特殊情况，那么测序也有可能存在信号杂。 补充上述11楼的建议：质粒重转化后，挑单克隆取5-6ml的菌液隔夜培养后，离心后弃去上清液，将沉淀后的菌体送测序，由测序公司直接抽提质粒后进行测序（即沉菌直抽），这样容易抽提到浓度较好的质粒，从而提高测序的成功率。 此外，当挑取的克隆样品为空载与带有插入片段的重组子的混合克隆时，用特异引物PCR进行鉴定，引物有可以结合的模板，产物以指数级进行增长，所以您在电泳时是可以看到特异条带的，但测序是用单条引物进行线性扩增，当模板量很少时，产物会更少，当进行荧光检测时，很有可能被当做背景峰或在峰图中完全不能够体现。还有含有少量重组子的混合克隆，在经过再次培养时空载体的增值速度大于重组子从而导致重组子的衰亡，在测序结果中显示空载。 解决办法是：在进行菌落PCR鉴定时，可采用一侧为载体上的通用引物，一侧为您的特异性引物进行鉴定，当条带单一且与您的目的片段长度一致则可以说明片段连接是成功的，如出现多条带，长度不符或无条带等情况，则说明连入片段可能有误。 |
17楼2012-09-07 09:58:13
2楼2012-06-05 18:55:49
504775490
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caoluoyuan
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