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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体构建，测序不成功
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-06 13:47:10
不清楚你是找的哪家测序公司，像这种测序图谱我遇到过很多次，说实话，出现这么乱的测序图谱，不代表你送去的质粒就是空载。
首先分析一下出现这种图谱的原因，第一是因为你的质粒浓度太低造成的，第二是质粒被污染了，第三是测序的问题，测序条件没有优化好，引物与模板没有很好的结合。
综上所述，建议你将你做PCR验证正确的质粒，重新转大肠杆菌，再重新抽提一次。像构建质粒这种工作，一定要将菌种和质粒保存好，否则很可能前功尽弃。我前几年构建穿梭质粒，由于当时是新手，浪费了一年的时间，现在想想很多问题都是可以避免的。
另外，楼上虫友们的意见也很对，可以选用载体上的通用引物测序，还有换家测序公司。
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11楼2012-06-06 11:12:06
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547star

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 芥末猫 at 2012-06-06 10:03:07
你好，你的意思是用我提的质粒转化大肠杆菌划线吗？...

如果重新连接有困难,就拿质粒再转化,挑几个单菌落培养,保藏,提质粒跑电泳看是否跟预期大小相似,是的话,拿一个质粒或保藏的菌种送测序.
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为什么
12楼2012-06-06 11:33:31
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jasonwyb123

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-06 13:47:22
如果你对自己的构建有信心的话 就新换家公司测测看
我们碰见这样的情况都是送个两三家公司看的
很多时候都会出错
还有
你送个菌液
让他们自己抽质粒测
有的公司老说你的质粒浓度不够啊之类的
所以干脆让他们自己提了再测好了
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13楼2012-06-06 11:36:44
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 足下客 at 2012-06-06 11:12:06
不清楚你是找的哪家测序公司，像这种测序图谱我遇到过很多次，说实话，出现这么乱的测序图谱，不代表你送去的质粒就是空载。
首先分析一下出现这种图谱的原因，第一是因为你的质粒浓度太低造成的，第二是质粒被污染 ...

说实话，做实验以来一直就不顺利，这个表达载体也构建了好久了，这次如果还是不对，我都不知道该怎么重做了，可能只能换载体换酶切位点了，关键是倍受打击的感觉太闹心了，而且不知道问题出在哪里，还了也不一定有用
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14楼2012-06-06 15:15:29
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水月寺学徒

金虫 (小有名气)

江湖浪子，行游诗人

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌落pcr检测不一定都靠谱的，建议提质粒做一个单单双酶切验证，酶切正确的话就直接送质粒去测序。
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活出生而为龙的狷狂
15楼2012-06-07 18:06:56
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wangmin2010

新虫 (小有名气)
引用回贴:
[说实话，做实验以来一直就不顺利，这个表达载体也构建了好久了，这次如果还是不对，我都不知道该怎么重做了，可能只能换载体换酶切位点了，关键是倍受打击的感觉太闹心了，而且不知道问题出在哪里，还了也不一定有用]

深有同感，我也在构建原核载体，可是一直不顺，也不知道问题出在什么地方，很是无助！
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自己的人生是要靠自己改变的！
16楼2012-07-31 20:08:33
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merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励积极热心应助 2012-09-07 13:39:14
引用回帖:
12楼: Originally posted by 547star at 2012-06-06 11:33:31
如果重新连接有困难,就拿质粒再转化,挑几个单菌落培养,保藏,提质粒跑电泳看是否跟预期大小相似,是的话,拿一个质粒或保藏的菌种送测序....

同意11楼的建议，从测序峰图来看，是信号杂，可能的原因是质粒浓度低。如果是用您PCR扩增引物进行测序的话，还可能存在引物不适合测序的情况。此外，如果您的质粒存在复杂结构，或者是GCrich等特殊情况，那么测序也有可能存在信号杂。
补充上述11楼的建议：质粒重转化后，挑单克隆取5-6ml的菌液隔夜培养后，离心后弃去上清液，将沉淀后的菌体送测序，由测序公司直接抽提质粒后进行测序（即沉菌直抽），这样容易抽提到浓度较好的质粒，从而提高测序的成功率。

此外，当挑取的克隆样品为空载与带有插入片段的重组子的混合克隆时，用特异引物PCR进行鉴定，引物有可以结合的模板，产物以指数级进行增长，所以您在电泳时是可以看到特异条带的，但测序是用单条引物进行线性扩增，当模板量很少时，产物会更少，当进行荧光检测时，很有可能被当做背景峰或在峰图中完全不能够体现。还有含有少量重组子的混合克隆，在经过再次培养时空载体的增值速度大于重组子从而导致重组子的衰亡，在测序结果中显示空载。
解决办法是：在进行菌落PCR鉴定时，可采用一侧为载体上的通用引物，一侧为您的特异性引物进行鉴定，当条带单一且与您的目的片段长度一致则可以说明片段连接是成功的，如出现多条带，长度不符或无条带等情况，则说明连入片段可能有误。
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17楼2012-09-07 09:58:13
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-09-07 13:39:34
PCR检测是不靠谱的，原核表达载体一般都是用酶切鉴定来检测的，如果酶切鉴定不正确也就没必要送测序，另外考虑到原核表达载体拷贝数低的问题，提质粒要多收菌，酶切鉴定也要根据浓度多加一点。
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18楼2012-09-07 10:13:47
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merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
18楼: Originally posted by huguangdong at 2012-09-07 10:13:47
PCR检测是不靠谱的，原核表达载体一般都是用酶切鉴定来检测的，如果酶切鉴定不正确也就没必要送测序，另外考虑到原核表达载体拷贝数低的问题，提质粒要多收菌，酶切鉴定也要根据浓度多加一点。

不太同意18楼的意见，由于现在酶切过程中常会出现”酶切星活性"的情况（即限制酶识别特殊的核苷酸序列，但是其识别位点特异性在体外可能会减弱。在某些特定的条件下，限制酶可以识别和切割与规范序列不同但可能是有同源性的核苷酸序列），因此建议最好是酶切和菌落PCR同时鉴定验证，确保实验结果的可靠性。
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19楼2012-09-08 01:20:16
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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
19楼: Originally posted by merryyiyi at 2012-09-08 01:20:16
不太同意18楼的意见，由于现在酶切过程中常会出现”酶切星活性"的情况（即限制酶识别特殊的核苷酸序列，但是其识别位点特异性在体外可能会减弱。在某些特定的条件下，限制酶可以识别和切割与规范序列不同但可 ...

星活性的出现和你选择哪个公司的酶以及何种酶还有酶切时间有关系，我做了两年的这方面实验，NEB和TAKARA的酶很少出现星活性，至少我没遇见过，MBI的没可能会有，但也不多见，酶切时间小雨2小时星活性是不会显现的，但PCR检测却容易出现假阳性，建议质粒检测以酶切为主。
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20楼2012-09-08 12:48:03
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