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芥末猫

银虫 (小有名气)

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[求助] 原核表达载体构建，测序不成功

郁闷死了，构建原核表达载体，提质粒电泳检测是大于两千，又用目的基因的引物做pcr检测，条带正确，然后送测序，告诉我可能是空载。。。。。。。
要是空载的话我pcr还能有目的条带吗？这个构建了好久了，一直没成功，快疯了

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1楼2012-06-05 18:49:02

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merryyiyi

铜虫 (初入文坛)

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专业: 生物化学

【答案】应助回帖

引用回帖:

18楼: Originally posted by huguangdong at 2012-09-07 10:13:47
PCR检测是不靠谱的，原核表达载体一般都是用酶切鉴定来检测的，如果酶切鉴定不正确也就没必要送测序，另外考虑到原核表达载体拷贝数低的问题，提质粒要多收菌，酶切鉴定也要根据浓度多加一点。

不太同意18楼的意见，由于现在酶切过程中常会出现”酶切星活性"的情况（即限制酶识别特殊的核苷酸序列，但是其识别位点特异性在体外可能会减弱。在某些特定的条件下，限制酶可以识别和切割与规范序列不同但可能是有同源性的核苷酸序列），因此建议最好是酶切和菌落PCR同时鉴定验证，确保实验结果的可靠性。