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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达载体构建，测序不成功
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芥末猫

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达载体构建，测序不成功

郁闷死了，构建原核表达载体，提质粒电泳检测是大于两千，又用目的基因的引物做pcr检测，条带正确，然后送测序，告诉我可能是空载。。。。。。。
要是空载的话我pcr还能有目的条带吗？这个构建了好久了，一直没成功，快疯了
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1楼 2012-06-05 18:49:02
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芥末猫

银虫 (小有名气)
这里还有张测序失败的图片，懂的给看看吧，谢谢啊
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2楼2012-06-05 18:55:49
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 547star at 2012-06-06 08:54:42
PCR真不好说的，影响因素太多，出来带不一定就是。测序峰套叠的多了点，但是也能看出每个位置有一个峰高很多。这种情况，我一般认为是质粒不纯或出现非特异性，可能是菌不纯或质粒提取被污染，建议划线纯化，直接挑 ...

你好，你的意思是用我提的质粒转化大肠杆菌划线吗？
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8楼2012-06-06 10:03:07
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 504775490 at 2012-06-05 20:41:23
这张测序图谱确实不怎么好，按楼主的说法应该是构建成功了，你可以送个菌液给公司，或者是换一家公司。我前几天也送质粒去测序了，也说有两个样测序失败，不过这个公司给返工重测了，结果测出来了，也有可能是公司的 ...

那个，我的菌液没有了。。。。质粒也就一点了。。。
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9楼2012-06-06 10:05:21
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芥末猫

银虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 足下客 at 2012-06-06 11:12:06
不清楚你是找的哪家测序公司，像这种测序图谱我遇到过很多次，说实话，出现这么乱的测序图谱，不代表你送去的质粒就是空载。
首先分析一下出现这种图谱的原因，第一是因为你的质粒浓度太低造成的，第二是质粒被污染 ...

说实话，做实验以来一直就不顺利，这个表达载体也构建了好久了，这次如果还是不对，我都不知道该怎么重做了，可能只能换载体换酶切位点了，关键是倍受打击的感觉太闹心了，而且不知道问题出在哪里，还了也不一定有用
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14楼2012-06-06 15:15:29
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