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芥末猫

银虫 (小有名气)

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[求助] 原核表达载体构建，测序不成功

郁闷死了，构建原核表达载体，提质粒电泳检测是大于两千，又用目的基因的引物做pcr检测，条带正确，然后送测序，告诉我可能是空载。。。。。。。
要是空载的话我pcr还能有目的条带吗？这个构建了好久了，一直没成功，快疯了

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1楼2012-06-05 18:49:02

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足下客

木虫 (正式写手)

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专业: 临床分子生物学检验

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-06-06 13:47:10

不清楚你是找的哪家测序公司，像这种测序图谱我遇到过很多次，说实话，出现这么乱的测序图谱，不代表你送去的质粒就是空载。
首先分析一下出现这种图谱的原因，第一是因为你的质粒浓度太低造成的，第二是质粒被污染了，第三是测序的问题，测序条件没有优化好，引物与模板没有很好的结合。
综上所述，建议你将你做PCR验证正确的质粒，重新转大肠杆菌，再重新抽提一次。像构建质粒这种工作，一定要将菌种和质粒保存好，否则很可能前功尽弃。我前几年构建穿梭质粒，由于当时是新手，浪费了一年的时间，现在想想很多问题都是可以避免的。
另外，楼上虫友们的意见也很对，可以选用载体上的通用引物测序，还有换家测序公司。