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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白表达不出来，是什么原因造成的
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小科研女dow

木虫 (小有名气)

[求助] 蛋白表达不出来，是什么原因造成的已有1人参与

各位虫友，我之前一直在做基因文库，好不容易从文库中筛到了具有我要的酶活性的克隆子。但是通过测序，是一条具有好几个阅读框的基因片段，但是发现并没有相似甚至相关的酶的基因，都是一些膜蛋白组件，还有几个是没有报道的未知蛋白，可是通过活性检测，明明是有活性的。
我的做法就是，将测序结果分析阅读框，挑了几个较大的阅读框（2000bp-500bp）都分别设计引物克隆表达，但是都做了4个了，都没有表达出蛋白，是一点都没有啊。
请问这是怎么回事？是不是不是所有的完整阅读框都能表达蛋白，只是有功能性的蛋白可以表达？
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做出色的科研人
1楼2013-06-20 18:19:36
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yanlinchun

铜虫 (小有名气)
还是在用毕赤酵母表达吗？
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6楼2013-08-10 16:49:47
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-06-22 18:47:33
你是在原核细胞中表达？我先按照这个说，若不是你说出来，我在按照真核表达系统说。
克隆金银的表达，除了需要启动子外，还要Shine-Dalgarno Sequence (SD序列）。Shine-Dalgarno Sequence一般位于-10及翻译起始密码子ATG之间，是mRNA与16SrRNA结合时所必须。Shine-Dalgarno Sequence与翻译起始密码子ATG之间的距离会影响基因的表达。此距离的大小与不同的启动子有关，一般7-9个碱基。
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2楼2013-06-20 21:53:35
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

要减少包涵体，可以在构建基因时构建融合基因，或者共表达能对目的基因起作用的分子伴侣的基因，以便改变目的基因产物的快速折叠，而且可能形成信号肽进行分泌表达或者形成金和层析标签。这样的方案不用降低温度培养细菌。

另外，基因的mRNA的5'末端的二级结构要适当减少一些，不要影响到SD和RBS序列，这样有利于核糖体的翻译。
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3楼2013-06-20 21:59:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+5, 鼓励交流 2013-06-22 18:49:41
高效质粒载体表达外源基因的一般方法（原核表达系统）:
（1）表达质粒的优化和设计：构建表达质粒时首先要考虑使目标基因的翻译起始密码ATG 与 SD 序列之间的距离和碱基组成处于一个适当的范围内。核糖体结合位点序列的变化对 mRNA 的翻译效率有显著影响，具体表现为：SD序列 UAAGGAGG的翻译效率要比 AAGGA 高3-6倍；翻译起始密码 ATG 与 UAAGGAGG的最适距离是6-8个碱基长度，与 AAGAA 的最适距离是5-7个碱基长度；ATG 与 UAAGGAGG 至少相隔 3-4个碱基，与 AAGAA 至少相隔5 个碱基mRNA 的翻译才能进行；ATG与SD序列之间的碱基组成为A，T 碱基丰富时，mRNA 翻译效率较高。其次，尽量提高核糖体结合位点本身和附近的序列中 A/T 碱基的含量，降低mRNA 5’ 端形成的“茎环”结构的可能性，也是构建表达质粒时需要注意的事项。在必要的情况下，还可通过定点突变，PCR 等技术改变个别关键的碱基来破坏mRNA 5’端的“茎环”结构。把目标基因设计成多顺反子结构，在大肠杆菌本身的高效翻译起始元件后加上第二个SD序列和目标基因，一起插入表达载体。这一方法通常适用于目标基因 5’端序列容易形成二级结构，而又不宜改变其序列的情形下。再者，在构建表达质粒时，充分利用各个基因的结构特征和特点，注意引入翻译增强子序列。（2）共表达大肠杆菌稀有密码子 tRNA 基因：由于同义密码子的使用频率与细胞内对应的tRNA的丰度有正比关系稀有密码子对应的tRNA的丰度很低，有可能在翻译过程中发生中止和移码突变。可采用1.通过基因突变把稀有密码子改变为其他使用频率高的同义密码子；2.在表达系统中共表达稀有密码子tRNA 基因，以提高大肠杆菌细胞内稀有密码子 tRNA 的丰度。（3）提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性：利用蛋白转运系统把目标蛋白最终累积在周质空间，或分泌到培养基中；采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作为宿主菌；对分子量较小的目标基因进行融合表达或串联聚合表达；共表达能提高特定目标蛋白稳定性的辅助因子，如分子伴侣基因；对蛋白质序列中的蛋白水解酶敏感区域和识别位点进行改造；在较低的温度下培养菌体和优化发酵条件。（4）高密度发酵和工程化宿主细胞：：大肠杆菌高密度发酵是大规模制备重组蛋白质过程中不可缺少的工艺步骤。其目的是在单个菌体对目标基因的表达水平基本不变的前提下，通过单位体积的菌体数量的成倍增加来实现总表达量的提高。目前常用的发酵方式有：恒定培养、流加补料培养、连续培养三种。工程化宿主细胞：1.构建出产乙酸能力低的工程化宿主菌是解决高密度发酵后期由于菌体的生长密度较高，培养基中的溶氧饱和度往往比较低，氧气的不足导致菌体生长速率降低和乙酸的累积，乙酸的存在对目标基因的高效表达有明显的阻抑作用的根本途径。利用透明颤菌血红蛋白能提高大肠杆菌在贫氧条件下对氧的利用率的生物学性质，把透明颤菌血红蛋白基因vgb 导入大肠杆菌细胞内以增加其对溶氧的宽容度。从而降低菌体产生乙酸所要求的溶氧饱和度阀值；用基因敲除技术缺失大肠杆菌的磷酸转乙酰酶基因 pta1 和乙酸激酶基因ackA，使从丙酮酸到乙酸的合成途径被阻断；改变代谢流的方向，通过共转化把枯草杆菌、酿酒酵母的乙酰乳酸合成酶基因 alsS，单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因 pdc1 和乙醇脱氢酶基因 adh2 导入大肠杆菌，使丙酮酸的代谢有选择地向生成3-羟基丁酮或乙醇的方向进行。2.构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主菌：rpoH基因编码大肠杆RNA聚合酶的r32亚基，r32 亚基对大肠杆菌中多种蛋白水解酶的活力有正调控作用。rpoH 基因缺陷的突变株己经被构建，研究结果表明它能明显提高目标基因的表达水平。
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4楼2013-06-20 22:01:05
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