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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白表达不出来是怎么回事？
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linsui1989

新虫 (小有名气)

[求助] 蛋白表达不出来是怎么回事？

我最近在做蛋白表达，重组质粒测序正确，但是表达出来和空载体一模一样，没有目的带，请问是怎么回事？

我用的是pet32a载体，酶切位点是BamH1和Xhol1,诱导温度是37度，IPTG浓度1mmol/L, 菌株为rosseta,全菌电泳
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1楼2012-11-30 15:19:17
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

姑射藐藐

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
linsui1989: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-04 15:05:40
第一步：确定载体序列是否正确，启示子、终止子、读码框等；
第二步：确定操作步骤是否正确，如载体是否被污染，是否成功转化入rossetta，抗生素是否正确等；
第三步：核对目的基因序列，与大肠杆菌常用密码子作对比，优化密码子；
第四步：以上三步没有问题时，若还不表达，更换载体；
第四步：更换载体还不表达，选择GST、MBP、SUMO、GB1等助溶标签融合表达。
另外，当目的蛋白太小或太大时可能都不易表达：小肽易被降解；太长例如大的膜蛋白等表达量往往也很难优化。
当然，表达温度以及诱导时间也会对蛋白的可溶表达有一定影响~ 但一般不会导致0和1的差别~
祝实验顺利~
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7楼2012-12-02 12:52:21
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小河虾

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
基因序列有没有稀少密码子?
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God helps the man who helps himself
2楼2012-11-30 15:32:25
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lihaizhen

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
这个真不好说，说明没有表达，载体的启动子区域除了问题，不然，如果目的基因连上，肯定有诱导表达的条带的
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3楼2012-11-30 15:38:04
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xiefl1984

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可能有很多种情况，是不是发酵过程中质粒丢失了。
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4楼2012-11-30 16:37:08
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2010221006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
在翻译的过程中受到阻碍
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5楼2012-11-30 17:10:01
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飒飒东风

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大三学生  飘过  。
1受体细胞选择要多样性
2.你确定导入到受体细胞了并随之稳定遗传复制。
3.是不是被受体细胞排斥啊  多试几个受体。
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和气生财研究也是
6楼2012-12-02 00:03:40
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Marado

金虫 (正式写手)

Dreamer

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
从楼主的条件来分析，温度，IPTG浓度都已经挺高了，温度试试降低一点看看，试试30摄氏度，27摄氏度之类的……
Rosseta本来就是用来表达稀有密码子的受体细胞，一般来说很难表达的基因在Rosseta里面都可以表达的，你可以试试换下受体细胞，个人觉得Rosseta已经是很强悍的受体细胞了.
再个就要从楼主的表达载体的构建分析了，再仔细分析一下构建好的表达载体，测序没？把测序结果好好分析一下，确定一下启动子，跟阅读框没有出问题.实在不行换个表达载体吧，这是下下策了，换载体很多东西都要重新考虑，换个pGEX系列吧，GST融合表达.
祝楼主好运
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Look,ifyouhadoneshot,oroneopportunity,toseizeeverythingyoueverwanted,inonemoment.Wouldyoucaptureit,orjustletitslip?
8楼2012-12-02 13:47:16
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first-006

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
9楼2012-12-08 02:00:27
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panyuzhu

禁虫 (小有名气)
本帖内容被屏蔽
10楼2013-04-26 20:25:55
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