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linsui1989

新虫 (小有名气)

应助: 5 (幼儿园)
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[求助] 蛋白表达不出来是怎么回事？

我最近在做蛋白表达，重组质粒测序正确，但是表达出来和空载体一模一样，没有目的带，请问是怎么回事？

我用的是pet32a载体，酶切位点是BamH1和Xhol1,诱导温度是37度，IPTG浓度1mmol/L, 菌株为rosseta,全菌电泳

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1楼 2012-11-30 15:19:17

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姑射藐藐

新虫 (初入文坛)

应助: 1 (幼儿园)
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专业: 生物大分子结构与功能

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
linsui1989: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-04 15:05:40

第一步：确定载体序列是否正确，启示子、终止子、读码框等；
第二步：确定操作步骤是否正确，如载体是否被污染，是否成功转化入rossetta，抗生素是否正确等；
第三步：核对目的基因序列，与大肠杆菌常用密码子作对比，优化密码子；
第四步：以上三步没有问题时，若还不表达，更换载体；
第四步：更换载体还不表达，选择GST、MBP、SUMO、GB1等助溶标签融合表达。
另外，当目的蛋白太小或太大时可能都不易表达：小肽易被降解；太长例如大的膜蛋白等表达量往往也很难优化。
当然，表达温度以及诱导时间也会对蛋白的可溶表达有一定影响~ 但一般不会导致0和1的差别~
祝实验顺利~