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linsui1989新虫 (小有名气)
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[求助]
蛋白表达不出来是怎么回事？
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我最近在做蛋白表达，重组质粒测序正确，但是表达出来和空载体一模一样，没有目的带，请问是怎么回事？ 我用的是pet32a载体，酶切位点是BamH1和Xhol1,诱导温度是37度，IPTG浓度1mmol/L, 菌株为rosseta,全菌电泳 |
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【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
linsui1989: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-04 15:05:40
感谢参与，应助指数 +1
linsui1989: 金币+2, ★★★很有帮助 2012-12-04 15:05:40
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第一步：确定载体序列是否正确，启示子、终止子、读码框等； 第二步：确定操作步骤是否正确，如载体是否被污染，是否成功转化入rossetta，抗生素是否正确等； 第三步：核对目的基因序列，与大肠杆菌常用密码子作对比，优化密码子； 第四步：以上三步没有问题时，若还不表达，更换载体； 第四步：更换载体还不表达，选择GST、MBP、SUMO、GB1等助溶标签融合表达。 另外，当目的蛋白太小或太大时可能都不易表达：小肽易被降解；太长例如大的膜蛋白等表达量往往也很难优化。 当然，表达温度以及诱导时间也会对蛋白的可溶表达有一定影响~ 但一般不会导致0和1的差别~ 祝实验顺利~ |
7楼2012-12-02 12:52:21
2楼2012-11-30 15:32:25
3楼2012-11-30 15:38:04
xiefl1984 
木虫 (小有名气)
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- 专业: 生物大分子结构与功能
4楼2012-11-30 16:37:08
5楼2012-11-30 17:10:01
6楼2012-12-02 00:03:40
Marado
金虫 (正式写手)
Dreamer
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【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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从楼主的条件来分析，温度，IPTG浓度都已经挺高了，温度试试降低一点看看，试试30摄氏度，27摄氏度之类的…… Rosseta本来就是用来表达稀有密码子的受体细胞，一般来说很难表达的基因在Rosseta里面都可以表达的，你可以试试换下受体细胞，个人觉得Rosseta已经是很强悍的受体细胞了. 再个就要从楼主的表达载体的构建分析了，再仔细分析一下构建好的表达载体，测序没？把测序结果好好分析一下，确定一下启动子，跟阅读框没有出问题.实在不行换个表达载体吧，这是下下策了，换载体很多东西都要重新考虑，换个pGEX系列吧，GST融合表达.  祝楼主好运 |
8楼2012-12-02 13:47:16
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9楼2012-12-08 02:00:27
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10楼2013-04-26 20:25:55
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