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新虫 (小有名气)

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[求助] 蛋白表达可不可能存在内含肽剪接

最近使用大肠杆菌大量表达一种细菌的细胞色素c。但是western验证的时候发现大小错误。同表达的其他细胞色素C都很正常，所以怀疑是不是有可能存在内含肽剪接。或者有其他可能？

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1楼2012-05-25 08:49:21

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凌波丽

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【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+3, MolEPI+1, 分析的很全面了哈 2012-05-25 13:52:51

蛋白质内含子剪切（protein cleavage）和剪接（protein splicing)都是有可能的，protein cleavage一般是由其他蛋白酶作用产生的，只是切不连接，protein splicing则不需要其他酶或者蛋白质作用，发生protein splicing的多肽自己就可以进行既切掉多肽序列中的一段或几段序列(inteins)又把剩下的序列重新连接在一起，而且重新连接的片段有时还会发生重排，比如伴刀豆蛋白不仅剪切掉中间一段序列，而且其原先的N-末端和C-末端序列，即所谓的exteins，彼此相对位置会发生交换，N-末端成为了成熟蛋白质的C-末端序列，C-末端成为了成熟蛋白质的N-末端序列。这样的protein splicing首先是有蛋白质的本身的一级和空间结构决定的。
阅读框改变，肯定蛋白质的一级结构就完全不同了。
还有是发生了RNA editing，这时可能会有终止密码改变或者中间的编码改变而引起蛋白质序列改变，进而引起蛋白质的空间结构改变。
蛋白质降解也是必须考虑的一个问题，这与表达的工程细胞中的蛋白酶有关，可以考虑使用分泌表达或者共表达。
Translational Hopping，及翻译时发生核糖体跳读，在同一条mRNA中有些密码子不翻译，这样的情比较少见。可能与mRNA形成二级结构或者密码子稀有性相关，如果是大肠杆菌，可能在营养极度缺乏时的应急反应也有关系。
不管什么原因，检测起来不难，首先做个表达的蛋白质的N-末端与C--末端，降解和提前终止或者不正常起始翻译一般都可以检测出来，再用同种酶同样条件下切割表达的蛋白质和正常的蛋白质标准品，然后分别走个电泳，可以比较出序列大致差异在何处，即肽谱分析。

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4楼2012-05-25 11:21:28

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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

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【答案】应助回帖

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小丹木木: 金币+2, 辛苦辛苦 2012-05-25 13:52:18

内含肽剪接这种现象是有的，如NEB公司的IMPACT System，利用的就是内含肽切除标签。
Chong S, Mersha FB, Comb DG,et al.Single-column purification of free recombinant proteins using a self-cleavable affinity tag derived from a protein splicing element [J]. Gene. 1997 192(2):271-81.

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2楼2012-05-25 10:44:27

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