| 查看: 3116 | 回复: 16 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
Atlantistree铁虫 (初入文坛)
|
[求助]
毕赤酵母表达时的杂蛋白问题 已有2人参与
|
|
|
我最近构建毕赤酵母X-33工程菌表达干扰素（20KD左右），摇瓶用BMMY表达时，蛋白很纯，没有40KD以上的蛋白，但是上罐后用基础盐离子培养基发酵后杂蛋白很多；之前还做过甘露聚糖酶（47KD左右）的表达，用基础盐离子上罐发酵时，表达蛋白很纯，没有杂蛋白。甘露聚糖酶和干扰素所用的穿梭质粒和毕赤酵母菌种完全相同，发酵工艺也相同。搞不清楚表达干扰素时，为何摇瓶表达没有杂蛋白，但是上罐后杂蛋白很多，而上罐表达甘露聚糖酶时，相同的发酵工艺，却没有杂蛋白，这种现象是由于菌体死亡造成的，还是和表达的蛋白有关？如果由于菌体自溶造成的，如何调整发酵工艺啊？求大神指点！ 附上蛋白电泳图，一张是干扰素的发酵罐表达，一张是甘露聚糖酶的发酵罐表达。  干扰素发酵罐表达.jpg  甘露聚糖酶发酵罐表达.jpg |
回复此楼» 猜你喜欢
求个博导看看
已经有19人回复
-
论文终于录用啦！满足毕业条件了
已经有13人回复
-
2025年遐想
已经有5人回复
-
投稿Elsevier的杂志（返修），总是在选择OA和subscription界面被踢皮球
已经有8人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 毕赤酵母将目的蛋白分泌到胞外，在30度下不会失活吗？酿酒酵母胞内表达会糖基化吗？
已经有18人回复
- 低温诱导蛋白表达时用多少度合适？
已经有16人回复
- WB检测蛋白表达量时关于上样量的问题？
已经有16人回复
- 外源蛋白在毕赤酵母中不表达
已经有18人回复
- 求助----原核表达问题：实际表达的蛋白大小与预测的相差较大
已经有69人回复
- 发酵液除去大分子蛋白
已经有7人回复
- 毕赤酵母表达蛋白纯化
已经有10人回复
- 重组牛胰蛋白酶在毕赤酵母中的表达
已经有8人回复
- 请教关于酵母诱导蛋白表达的问题alpha-factor是什么东西？
已经有7人回复
- 蛋白的表达量低不稳定怎么办
已经有11人回复
- 高拷贝毕赤酵母表达出来的蛋白也是多拷贝的嘛还是自动酶切变成单体蛋白了
已经有6人回复
- 毕赤酵母表达一直不表达
已经有13人回复
- SDS PAGE 小肽？
已经有15人回复
- 毕赤表达一酶基因，跑蛋白电泳只有一条带，是不是不用纯化了呀
已经有10人回复
- 原核表达，蛋白活性问题
已经有12人回复
- 毕赤酵母表达问题求教
已经有19人回复
- 毕赤酵母表达的蛋白带的大小
已经有4人回复
- 毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
已经有18人回复
- 毕赤酵母表达的蛋白无活性
已经有8人回复
- 大家见到过毕赤酵母表达出的外源蛋白分子量比实际分子量小吗，而且还有活性？
已经有20人回复
- 毕赤酵母转化表达
已经有13人回复
- 【求助/交流】用毕赤酵母表达载体pPIC9K表达蛋白时分子量的估计？
已经有4人回复
- 毕赤酵母怎么表达不出融合蛋白？
已经有14人回复
- 【资料】毕赤酵母表达系统操作手册
已经有362人回复
- 【求助/交流】毕赤酵母表达用培养基BMGY BMMY的详细配制方法，请赐教。
已经有14人回复
- 【求助/交流】请问毕赤酵母胞外胞外表达有酶活不蛋白，正常吗？
已经有8人回复
- 【求助/交流】非特异性酶切
已经有3人回复
- 毕赤酵母表达（总是整合不上）
已经有17人回复
Atlantistree
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 461
- 帖子: 20
- 在线: 58.1小时
- 虫号: 1490513
- 注册: 2011-11-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
3楼2014-01-23 08:29:01
Atlantistree
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 461
- 帖子: 20
- 在线: 58.1小时
- 虫号: 1490513
- 注册: 2011-11-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
|
是直接上的发酵上清跑的电泳；质粒用的是PICZαA；发酵过程大概是上罐后36~42小时左右甘油补料长生物量，之后是甲醇诱导，甲醇补料速度先慢后快，根据溶氧控制补料速度，溶氧控制在30%左右。干扰素序列中有一个潜在糖基化位点，但糖基化对蛋白分子量的影响应该不会特别大吧。上面干扰素电泳图中，40KD以上的都是杂蛋白，不同的泳道是不同发酵时间取的样品。干扰素这个菌种我也上过很多次罐了，都有杂蛋白，估计这杂蛋白很有可能是菌体死亡后产生的，但是发酵工艺与甘露聚糖酶的大致相同，不知为何会出现这种状况。你说的酶活性和干扰素活性都能检测出来，但是干扰素有杂蛋白，使后面的纯化还要过离子交换柱什么的，就比较麻烦。 |
6楼2014-02-02 16:04:39
Atlantistree
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 461
- 帖子: 20
- 在线: 58.1小时
- 虫号: 1490513
- 注册: 2011-11-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
|
蛋白在菌体内折叠修饰是耗氧过程，溶氧不足会影响蛋白活性，这个我在做甘露聚糖酶发酵时溶氧是否充足活性变化很明显，而且看很多文献基本上都把溶氧控制在20%-50%。在补料过程中通富氧空气，蠕动泵一工作补甲醇，溶氧就开始下降，当溶氧升到50%左右时开始下一次补料，这个过程时间不是很长，会因为碳源不够造成菌体死亡么？ 开始诱导后发酵液的OD值我倒是没测过，我是用湿菌重来衡量，湿菌重达到200 mg/mL左右时开始诱导，诱导期生物量也在增长，但比较缓慢，最后能达到湿菌重350 mg/mL左右。是不是在诱导阶段控制生物量维持恒定会比较好？估计杂蛋白是菌体死亡裂解出来的，很多文献里酵母表达的蛋白电泳图中都含有40KD以上的杂蛋白，这或许是种普遍现象？像我做的甘露聚糖酶这种杂蛋白很少的情况可能比较特殊，就是搞不明白是怎么造成的…… 太客气了，还没感谢你参与讨论呢…… |
8楼2014-02-11 11:31:40
Atlantistree
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 461
- 帖子: 20
- 在线: 58.1小时
- 虫号: 1490513
- 注册: 2011-11-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
10楼2014-02-13 09:03:30
Atlantistree
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 461
- 帖子: 20
- 在线: 58.1小时
- 虫号: 1490513
- 注册: 2011-11-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
14楼2014-02-17 09:30:11
Atlantistree
铁虫 (初入文坛)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 461
- 帖子: 20
- 在线: 58.1小时
- 虫号: 1490513
- 注册: 2011-11-14
- 性别: GG
- 专业: 微生物生理与生物化学
16楼2014-02-18 10:34:07