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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 毕赤酵母表达时的杂蛋白问题
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Atlantistree

铁虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达时的杂蛋白问题 已有2人参与

我最近构建毕赤酵母X-33工程菌表达干扰素（20KD左右），摇瓶用BMMY表达时，蛋白很纯，没有40KD以上的蛋白，但是上罐后用基础盐离子培养基发酵后杂蛋白很多；之前还做过甘露聚糖酶（47KD左右）的表达，用基础盐离子上罐发酵时，表达蛋白很纯，没有杂蛋白。甘露聚糖酶和干扰素所用的穿梭质粒和毕赤酵母菌种完全相同，发酵工艺也相同。搞不清楚表达干扰素时，为何摇瓶表达没有杂蛋白，但是上罐后杂蛋白很多，而上罐表达甘露聚糖酶时，相同的发酵工艺，却没有杂蛋白，这种现象是由于菌体死亡造成的，还是和表达的蛋白有关？如果由于菌体自溶造成的，如何调整发酵工艺啊？求大神指点！
附上蛋白电泳图，一张是干扰素的发酵罐表达，一张是甘露聚糖酶的发酵罐表达。
毕赤酵母表达时的杂蛋白问题
干扰素发酵罐表达.jpg


毕赤酵母表达时的杂蛋白问题-1
甘露聚糖酶发酵罐表达.jpg
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上善若水
1楼 2014-01-22 11:31:19
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vetzhang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by Atlantistree at 2014-02-17 09:30:11
嗯，摇瓶表达的也是两条带。之前上罐用BSM培养基，盐离子浓度太强，再做上罐换成BMMY试一下，看看杂蛋白是否会少些。之前都是做上游工作，后续纯化了解的比较少，要从上清中得到比较纯的蛋白需要经过超滤和过柱层析 ...

当然最好是表达是目的蛋白越纯净越好，这样后续纯化就省老劲了。纯化的话如果没有融合标签的话，一般需要经过离子交换层析 凝胶过滤层析等柱上纯化，如果带标签比如his标签，首先建议亲和层系。
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15楼2014-02-17 18:39:45
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lcat

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
Atlantistree: 金币+5, ★有帮助, 感谢帮助 2014-01-23 10:36:18
是干扰素蛋白产量低吗？干扰素和甘露聚糖酶这两张电泳图，发酵液上样体积是一样的吗？
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2楼2014-01-22 21:21:09
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Atlantistree

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by lcat at 2014-01-22 21:21:09
是干扰素蛋白产量低吗？干扰素和甘露聚糖酶这两张电泳图，发酵液上样体积是一样的吗？

嗯，干扰素产量是比较低。上样量不一样，甘露聚糖酶的上样量大概有5微吧，这是好早之前做的图。近期做过一次甘露聚糖酶的发酵上样量20微，与干扰素的上样量相同，但还是没有杂蛋白，我就很纠结……
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上善若水
3楼2014-01-23 08:29:01
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

看你的描述和电泳图，都是胞外表达，直接发酵液上清上样是吧？组成型还是诱导型表达？用的BMMY和盐培养基，应该是诱导型，需要看你的质粒图谱（标明各元件即可）还有发酵大体步骤。

初步推断：毕赤酵母表达外源蛋白时，会有不同程度的糖基化现象，上罐进行高密度发酵的糖基化现象肯定比摇瓶要明显很多。另外，你的产物电泳显示有杂蛋白，建议进行2个实验，western blot和酶活测试。

还有毕赤酵母的上罐可能不能较频繁，所以建议多做几罐比较下结果。

上述5个问题的情况能够详细描述的话，问题应该能够确定。
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4楼2014-01-26 12:14:39
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