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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 毕赤酵母表达时的杂蛋白问题
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reallpf

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by Atlantistree at 2014-02-13 09:03:30
多谢帮忙，我再多做几批试一下。
另外在上罐时，你使用的是Invitrogen提供的BSM培养基么？我看有文献用的培养基盐离子浓度比BSM低好多，在甘油/甲醇补料阶段也要分别补加培养基，不知你做过类似的工艺实验没？...

一般是BSM，但都会做一些改良的，调整各个成分。我做工业表达，所以原料也都是非常粗糙的。后续补料过程中，一般不再添加其它培养基了。
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11楼2014-02-13 22:09:12
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vetzhang

金虫 (小有名气)
不知道楼主摇瓶表达的时候SDS-PAGE干扰素的目的带是单一条带还是18kda上下的2条带，从你图一来看应当是2条带，在糖基化现象存在下，（未对干扰素进行糖基化位点修饰的情况下）分泌表达的干扰素大多呈现在Page上是2条及2条以上条带，且容氧量越大，糖基化的蛋白比重越大。
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12楼2014-02-16 13:59:28
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vetzhang

金虫 (小有名气)
没编辑完就回复了。接着说哈，从我实验的经验来看，随着表达时间和菌体浓度的怎加，反映在Page上，在100和50KDA处有杂蛋白。理论上来讲容氧量在30%的情况下杂蛋白不应当这么多，对比我摇瓶表达的干扰素和发酵罐用BMMY培养基表达的I和II型干扰素，都存在楼主所示图一的杂蛋白，但是杂蛋白量较低，经过纯化后，也获得较为纯净的干扰素蛋白。即便含杂蛋白的硫酸铵沉淀的发酵上清PBS透析后，生物活性依然很高。所以楼主要是解决不了发酵杂蛋白多的问题，不如在后续纯化上下下功夫吧。
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13楼2014-02-16 14:23:44
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Atlantistree

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by vetzhang at 2014-02-16 14:23:44
没编辑完就回复了。接着说哈，从我实验的经验来看，随着表达时间和菌体浓度的怎加，反映在Page上，在100和50KDA处有杂蛋白。理论上来讲容氧量在30%的情况下杂蛋白不应当这么多，对比我摇瓶表达的干扰素和发酵罐用BM ...

嗯，摇瓶表达的也是两条带。之前上罐用BSM培养基，盐离子浓度太强，再做上罐换成BMMY试一下，看看杂蛋白是否会少些。之前都是做上游工作，后续纯化了解的比较少，要从上清中得到比较纯的蛋白需要经过超滤和过柱层析两步纯化吧？
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上善若水
14楼2014-02-17 09:30:11
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vetzhang

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by Atlantistree at 2014-02-17 09:30:11
嗯，摇瓶表达的也是两条带。之前上罐用BSM培养基，盐离子浓度太强，再做上罐换成BMMY试一下，看看杂蛋白是否会少些。之前都是做上游工作，后续纯化了解的比较少，要从上清中得到比较纯的蛋白需要经过超滤和过柱层析 ...

当然最好是表达是目的蛋白越纯净越好，这样后续纯化就省老劲了。纯化的话如果没有融合标签的话，一般需要经过离子交换层析 凝胶过滤层析等柱上纯化，如果带标签比如his标签，首先建议亲和层系。
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15楼2014-02-17 18:39:45
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Atlantistree

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
15楼: Originally posted by vetzhang at 2014-02-17 18:39:45
当然最好是表达是目的蛋白越纯净越好，这样后续纯化就省老劲了。纯化的话如果没有融合标签的话，一般需要经过离子交换层析 凝胶过滤层析等柱上纯化，如果带标签比如his标签，首先建议亲和层系。...

嗯，多谢分享经验！
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上善若水
16楼2014-02-18 10:34:07
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allanq

新虫 (初入文坛)
楼主，后来问题怎么解决的，找到原因了么，我也遇到相同问题

发自小木虫IOS客户端
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17楼2016-12-02 09:46:15
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