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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
10楼: Originally posted by phoenixcc at 2011-09-11 23:17:11:
哎，做生物就这样，要是有问题，就得从上游查到下游，哪里都可能出问题，要是没问题一次成功，几乎是万幸中的万幸，但能不能重复又不晓得，这是悲催。。。

呵呵，这也是没办法的事情呀,做分子的都不容易呀。还好各位战友人都很好，大家有问题的时候可以一起交流交流~~
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11楼2011-09-12 23:38:44
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skpom

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做毕赤酵母表达好长时间了，从表达载体的构建到连接、转化、筛选、鉴定，现在开始用甲醇诱导，但是测酶活一直没有，跑SDS-PAGE在预计的片段位置有条带（因为外缘表达，蛋白含量低），因为没有合适的抗体不能做Western，蛋白有HIS标签，因为测不出酶活下面没法继续做。
        1、转化子表型鉴定
        2、采用G418浓度梯度筛选毕赤酵母高拷贝转化子
         3、PCR验证毕赤酵母转化子
        4、毕赤酵母中重组蛋白的诱导表达
        5、蛋白质的浓缩
        6、镍离子螯合层析柱纯化角蛋白酶
         7、 重组角蛋白酶酶学性质研究
1、2、3步都得到了满意的结果，可以说明目的基因片段已转进去，但是诱导表达没有酶活，诱导条件是：
        接种于5ml BMGY培养基，于30℃，250rpm摇床培养至OD600为2-6.0，离心收集菌体，转接到装有50ml BMMY培养基的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为0.5%，诱导表达7天。
        第二天起每天取2ml样，离心，沉淀和上清分别保存于-20度冰箱留做测酶活和SDS-PAGE，确定最佳收获时间。
        大家看看有什么问题不，请求指教，谢！！！
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携手共创科技论坛
12楼2012-03-02 16:40:37
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doughtiness

新虫 (小有名气)
兔兔yy070330,你好！请问你后来的表达与酶活的问题怎么解决的呢？我最近也是在做把细菌中的基因连接到真菌载体，再转化到酵母，求指点
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13楼2013-07-24 16:11:19
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doughtiness

新虫 (小有名气)
您好，您在最后的分泌表达做的怎么样啊？我最近出现了跟您一样的情况，有蛋白但就是没有活性
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14楼2013-10-22 15:27:06
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learningying

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by phoenixcc at 2011-09-10 19:35:13
操作基本正确，酵母表达过的蛋白可能会有甲基化现象，要不你用软件测一下目的片段，优化一下再表达试试。

请问用什么软件呢？谢谢啊。。。我也在做着块儿。
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加油，天道酬勤
15楼2014-09-06 22:38:27
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
13楼: Originally posted by doughtiness at 2013-07-24 16:11:19
兔兔yy070330,你好！请问你后来的表达与酶活的问题怎么解决的呢？我最近也是在做把细菌中的基因连接到真菌载体，再转化到酵母，求指点

不好意思，才看到回帖。我根据大家的建议重新尝试了几次，对密码子也做了一点优化，做了一个基因的点突变，后面酶活有蛮明显提高的。不知道你的实验进展如何了，祝顺利呦~~
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16楼2014-09-16 11:11:36
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
14楼: Originally posted by doughtiness at 2013-10-22 15:27:06
您好，您在最后的分泌表达做的怎么样啊？我最近出现了跟您一样的情况，有蛋白但就是没有活性

不好意思，才看到回帖。我根据大家的建议重新尝试了几次，对密码子也做了一点优化，做了一个基因的点突变，后面酶活有蛮明显提高的。不知道你的实验进展如何了，祝顺利呦~~
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17楼2014-09-16 11:11:53
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yuyxwr

新虫 (初入文坛)
真核细胞表达原核基因的确容易出问题，这个重组蛋白应该多出一段来自载体的分泌信号序列吧，它在N端还是C端？位置不对的话可能影响活性，把这段信号肽去掉也许就也活性了。
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18楼2014-10-29 21:18:12
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
7楼: Originally posted by ybs007 at 2011-09-11 13:12:13
阳性克隆测序了么？ 密码子优化了么？你这个蛋白是否有二硫键？
如果这些因素都没问题的话，那么多半是蛋白表达后折叠有问题，做下复性试试。

请问怎么知道蛋白有没有二硫键？
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19楼2018-04-27 14:08:18
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