| 查看: 3991 | 回复: 18 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
|
||
|
各位大虾，小妹最近用毕赤酵母KM71和GS115表达一个水解酶，该酶在原始菌中是分泌表达的。我利用的是pPIC9K质粒，构建的质粒电转进两个宿主，取空的pPIC9K质粒电转酵母细胞作为阴性对照。另外在涂板的时候我把制备的感受态细胞也涂了MD板，没有长出来，感受态应该是没有问题。我是直接用1mg/ml的G418 MD板进行筛选阳性菌落，，过了48小时左右长出菌落，是白色的，形态也很像酵母。将这些菌落接入含有1mg/ml的G418 MD液体培养基，提取基因组用通用引物AOX3'、AOX5'和自己的特异性引物进行PCR都扩出了条带，大小也和目的基因大小相当。之后接种到BMGY培养基，过夜培养后转接到BMMY培养基，每天补加甲醇至终浓度为1%，之后每天取样测酶活，第6天的时候取上清液进行SDS-PAGE检测，有表达条带，大小也和预测的目的蛋白大小相当。但就是没有活性。做了80%硫酸铵沉淀，仍然没有活性。 最近老板催的紧，压力很大。请各位帮我分析分析，我的操作有没有什么问题，大恩不言谢  |
回复此楼» 猜你喜欢
遇见不省心的家人很难过
已经有13人回复
-
博士延得我，科研能力直往上蹿
已经有4人回复
-
退学或坚持读
已经有24人回复
-
免疫学博士有名额，速联系
已经有14人回复
-
面上基金申报没有其他的参与者成吗
已经有4人回复
-
多组分精馏求助
已经有6人回复
doughtiness
新虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 186.5
- 散金: 25
- 红花: 1
- 帖子: 81
- 在线: 24.2小时
- 虫号: 1334671
- 注册: 2011-06-30
- 性别: MM
- 专业: 生物化学
13楼2013-07-24 16:11:19
2楼2011-09-07 09:27:18
3楼2011-09-07 16:40:00
dhmdddd
木虫 (正式写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 贵宾: 0.01
- 金币: 3930.1
- 散金: 939
- 红花: 3
- 帖子: 815
- 在线: 561.1小时
- 虫号: 839789
- 注册: 2009-09-03
- 性别: MM
- 专业: 微生物遗传育种学
4楼2011-09-07 17:00:07