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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)

[求助] 毕赤酵母表达出蛋白但没有活性

各位大虾，小妹最近用毕赤酵母KM71和GS115表达一个水解酶，该酶在原始菌中是分泌表达的。我利用的是pPIC9K质粒，构建的质粒电转进两个宿主，取空的pPIC9K质粒电转酵母细胞作为阴性对照。另外在涂板的时候我把制备的感受态细胞也涂了MD板，没有长出来，感受态应该是没有问题。我是直接用1mg/ml的G418 MD板进行筛选阳性菌落，，过了48小时左右长出菌落，是白色的，形态也很像酵母。将这些菌落接入含有1mg/ml的G418 MD液体培养基，提取基因组用通用引物AOX3'、AOX5'和自己的特异性引物进行PCR都扩出了条带，大小也和目的基因大小相当。之后接种到BMGY培养基，过夜培养后转接到BMMY培养基，每天补加甲醇至终浓度为1%，之后每天取样测酶活，第6天的时候取上清液进行SDS-PAGE检测，有表达条带，大小也和预测的目的蛋白大小相当。但就是没有活性。做了80%硫酸铵沉淀，仍然没有活性。
    最近老板催的紧，压力很大。请各位帮我分析分析，我的操作有没有什么问题，大恩不言谢
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1楼 2011-09-06 22:08:33
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
7楼: Originally posted by ybs007 at 2011-09-11 13:12:13
阳性克隆测序了么？ 密码子优化了么？你这个蛋白是否有二硫键？
如果这些因素都没问题的话，那么多半是蛋白表达后折叠有问题，做下复性试试。

请问怎么知道蛋白有没有二硫键？
赞一下 回复此楼
19楼2018-04-27 14:08:18
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86269480

金虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
lstt09nk(金币+1): 感谢参与 2011-09-12 11:47:24
个人认为步骤没有问题的，再Western鉴定确认下对应分子量的条带确实是你的目的蛋白吧。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-09-07 09:27:18
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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 86269480 at 2011-09-07 09:27:18:
个人认为步骤没有问题的，再Western鉴定确认下对应分子量的条带确实是你的目的蛋白吧。

恩，谢谢了
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3楼2011-09-07 16:40:00
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dhmdddd

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 鼓励交流 2011-09-12 11:47:14
真核细胞表达原核细胞的蛋白是会存在很多问题，是不是里面的氨基酸表达的不对影响你蛋白的活性什么的？大小对，中间氨基酸不对的话也会影响活性的吧，呵呵，祝好~
赞一下(1人) 回复此楼
上班族，学习ing……
4楼2011-09-07 17:00:07
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