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兔兔yy070330

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 毕赤酵母表达出蛋白但没有活性

各位大虾，小妹最近用毕赤酵母KM71和GS115表达一个水解酶，该酶在原始菌中是分泌表达的。我利用的是pPIC9K质粒，构建的质粒电转进两个宿主，取空的pPIC9K质粒电转酵母细胞作为阴性对照。另外在涂板的时候我把制备的感受态细胞也涂了MD板，没有长出来，感受态应该是没有问题。我是直接用1mg/ml的G418 MD板进行筛选阳性菌落，，过了48小时左右长出菌落，是白色的，形态也很像酵母。将这些菌落接入含有1mg/ml的G418 MD液体培养基，提取基因组用通用引物AOX3'、AOX5'和自己的特异性引物进行PCR都扩出了条带，大小也和目的基因大小相当。之后接种到BMGY培养基，过夜培养后转接到BMMY培养基，每天补加甲醇至终浓度为1%，之后每天取样测酶活，第6天的时候取上清液进行SDS-PAGE检测，有表达条带，大小也和预测的目的蛋白大小相当。但就是没有活性。做了80%硫酸铵沉淀，仍然没有活性。
最近老板催的紧，压力很大。请各位帮我分析分析，我的操作有没有什么问题，大恩不言谢

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1楼 2011-09-06 22:08:33

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skpom

金虫 (小有名气)

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专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

做毕赤酵母表达好长时间了，从表达载体的构建到连接、转化、筛选、鉴定，现在开始用甲醇诱导，但是测酶活一直没有，跑SDS-PAGE在预计的片段位置有条带（因为外缘表达，蛋白含量低），因为没有合适的抗体不能做Western，蛋白有HIS标签，因为测不出酶活下面没法继续做。
      1、转化子表型鉴定
      2、采用G418浓度梯度筛选毕赤酵母高拷贝转化子
      3、PCR验证毕赤酵母转化子
      4、毕赤酵母中重组蛋白的诱导表达
      5、蛋白质的浓缩
      6、镍离子螯合层析柱纯化角蛋白酶
      7、重组角蛋白酶酶学性质研究
1、2、3步都得到了满意的结果，可以说明目的基因片段已转进去，但是诱导表达没有酶活，诱导条件是：
      接种于5ml BMGY培养基，于30℃，250rpm摇床培养至OD600为2-6.0，离心收集菌体，转接到装有50ml BMMY培养基的500ml三角瓶中，相同培养条件继续培养，每24小时补加100％甲醇于培养基至终浓度为0.5%，诱导表达7天。
      第二天起每天取2ml样，离心，沉淀和上清分别保存于-20度冰箱留做测酶活和SDS-PAGE，确定最佳收获时间。
      大家看看有什么问题不，请求指教，谢！！！