| 查看: 4579 | 回复: 18 | ||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | ||
[求助]
毕赤酵母表达出蛋白但没有活性
|
||
|
各位大虾，小妹最近用毕赤酵母KM71和GS115表达一个水解酶，该酶在原始菌中是分泌表达的。我利用的是pPIC9K质粒，构建的质粒电转进两个宿主，取空的pPIC9K质粒电转酵母细胞作为阴性对照。另外在涂板的时候我把制备的感受态细胞也涂了MD板，没有长出来，感受态应该是没有问题。我是直接用1mg/ml的G418 MD板进行筛选阳性菌落，，过了48小时左右长出菌落，是白色的，形态也很像酵母。将这些菌落接入含有1mg/ml的G418 MD液体培养基，提取基因组用通用引物AOX3'、AOX5'和自己的特异性引物进行PCR都扩出了条带，大小也和目的基因大小相当。之后接种到BMGY培养基，过夜培养后转接到BMMY培养基，每天补加甲醇至终浓度为1%，之后每天取样测酶活，第6天的时候取上清液进行SDS-PAGE检测，有表达条带，大小也和预测的目的蛋白大小相当。但就是没有活性。做了80%硫酸铵沉淀，仍然没有活性。 最近老板催的紧，压力很大。请各位帮我分析分析，我的操作有没有什么问题，大恩不言谢  |
回复此楼» 猜你喜欢
大佬帮着分析今年的评审意见？该课题连续申请了三年了，明年要不要换个方向。
已经有11人回复
-
两块石头
已经有10人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急
已经有6人回复
-
售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急
已经有6人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急
已经有4人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急
已经有6人回复
-
售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急
已经有6人回复
-
售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急
已经有8人回复
-
售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急
已经有6人回复
17楼2014-09-16 11:11:53
2楼2011-09-07 09:27:18
3楼2011-09-07 16:40:00
dhmdddd
木虫 (正式写手)
- 应助: 10 (幼儿园)
- 贵宾: 0.01
- 金币: 3930.1
- 散金: 939
- 红花: 3
- 帖子: 815
- 在线: 561.1小时
- 虫号: 839789
- 注册: 2009-09-03
- 性别: MM
- 专业: 微生物遗传育种学
4楼2011-09-07 17:00:07
100