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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 蛋白成功表达，却没有活性，换个表达系统有必要吗？
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lijunzjut

铜虫 (小有名气)

[求助] 蛋白成功表达，却没有活性，换个表达系统有必要吗？ 已有2人参与

各位大虾，求助一个问题。
      从霉菌里克隆出一段酶的基因，经过稀有密码子修饰，成功表达在大肠（BL21）里, 经过sds-page检测发现在上清液里的确出现了清晰条带，说明我的蛋白可以可溶性表达，但是在检测酶的活性时，发现其活性极低（有，但可以忽略不计），请问，有没有必要尝试表达在酵母系统里再试试。蛋白在不同的系统里活性会有质的区别吗？毕竟我是真核表达在原核里。求大家支招。谢谢。
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1楼 2014-09-05 14:43:35
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laozuzunzhe

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lijunzjut: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-06 10:27:38
两种处理方法：
1、换真核系统，比如酵母，因为可能是由于大肠杆菌系统中没有辅助你目标蛋白折叠的酶系统；PS：大肠自己一般不能进行表达后修饰
2、体外复性。培养过程中添加低分子量的巯基或二硫化合物，促进二硫键的形成。
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2楼2014-09-05 15:51:53
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bio_sci

捐助贵宾 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lijunzjut: 金币+5, ★★★很有帮助 2014-09-06 10:27:47
必须换酵母，我做过一个丝状真菌的淀粉酶，大肠表达一点活性都没有，换到酵母系统，活性很高，绝对是这个原因

[ 发自小木虫客户端 ]
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3楼2014-09-05 20:49:11
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小小cool

金虫 (正式写手)
推荐用pcold1-sumo载体

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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4楼2014-09-05 20:55:25
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冼亮淀粉酶

专家顾问 (知名作家)

生物大分子降解酶
编码序列确保正确吗？如果是以DNA为模板克隆出来再去除理论上的内含子，那毕竟还是不确切的。
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流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
5楼2014-09-06 01:48:26
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lijunzjut

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by laozuzunzhe at 2014-09-05 15:51:53
两种处理方法：
1、换真核系统，比如酵母，因为可能是由于大肠杆菌系统中没有辅助你目标蛋白折叠的酶系统；PS：大肠自己一般不能进行表达后修饰
2、体外复性。培养过程中添加低分子量的巯基或二硫化合物，促进二硫 ...

好的，知道了。
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6楼2014-09-06 10:27:09
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yuyxwr

新虫 (初入文坛)
很多酶需要经共价修饰才有活性，如磷酸化、酰基化、糖基化修饰等。原核的蛋白加工修饰较少，可以先检测一下来源菌株霉菌中提取的酶是否有修饰。如果有，还是用真核表达更好。
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7楼2014-10-29 21:25:02
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huangrui1988

铜虫 (小有名气)
试试用orgami b菌株，或者有效果。
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8楼2014-10-31 01:16:27
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