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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 怎样相处蛋白之间相互作用却不改变蛋白活性？
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dshlove

木虫 (正式写手)

[交流] 怎样相处蛋白之间相互作用却不改变蛋白活性？

最近在纯化蛋白：
交代背景;
遇到一个问题就是杂蛋白与目的蛋白以某种方式（可能是疏水，也可能是共价键，也有可能是其他的作用方式）结合，导致纯化过程中杂蛋白始终伴随着目的蛋白。无论是过离子交换还是过分子筛，都是同样结果。
问题是;
有没有一种试剂或者缓冲液可以消除蛋白之间的相互作用，同时却不影响蛋白的活性？（目前已经在样品中加入了10mM DTT）
是否稀释蛋白，使浓度降低，可以缓解这种情况。

求高手解答！
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1楼 2013-04-03 13:31:57
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

auroraA

铁虫 (初入文坛)
★ ★
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dshlove: 金币+1 2013-04-04 11:25:01
是从细菌里提得吗? 杂蛋白是大约70kDa吗?
另外可以考虑RIPA buffer,但是因为含有少量的SDS,对目的蛋白的影响不太好说,但是值得一试
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3楼2013-04-04 01:10:03
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wchuangqi

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
dshlove: 金币+1 2013-04-04 11:24:56
加低浓度的detergent不知道可否
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4楼2013-04-04 06:52:10
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hudazhangyi

银虫 (正式写手)
★ ★
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dshlove: 金币+1 2013-04-04 11:21:47
不知道你有没有目的蛋白的抗体或买到抗体，做一下亲和层析
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5楼2013-04-04 10:47:56
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wchuangqi at 2013-04-04 06:52:10
加低浓度的detergent不知道可否

谢谢，试过了家triton了，没什么效果。
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7楼2013-04-04 11:22:34
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by auroraA at 2013-04-04 01:10:03
是从细菌里提得吗? 杂蛋白是大约70kDa吗?
另外可以考虑RIPA buffer,但是因为含有少量的SDS,对目的蛋白的影响不太好说,但是值得一试

是大肠杆菌里表达的蛋白。
杂蛋白主要是70kDa还有35kDa，两条。
RIPA buffer是什么，能否告诉下配方？
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8楼2013-04-04 11:24:51
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auroraA

铁虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
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dshlove: 金币+3 2013-04-04 17:21:12
引用回帖:
8楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-04 11:24:51
是大肠杆菌里表达的蛋白。
杂蛋白主要是70kDa还有35kDa，两条。
RIPA buffer是什么，能否告诉下配方？...

70kda的是heatshock,加点ATP就和你的蛋白分开了. 35的不知道是什么.如果比你的蛋白小,可能是降解产物,因为细菌里有点降解,或者纯化过程中的降解很普遍,这根据每个蛋白的性质而异.比如p35这个蛋白,想拿到50%"纯"的都难,因为多数都降解了. 如果比你的蛋白大,可能是多聚,或者降解加多聚,SDS也打不开,这也很普遍.
RIPA buffer的 配方记不得了,得去查.不过最重要的成分就是0.1%的SDS,其他的成分随便看着加吧,不外乎就是NaCl,Tris,detergent之类的.RIPA一般是做细胞的人用得多,缺点是SDS可能会插入你的蛋白,可能会影响蛋白活性或结合.但是这也因蛋白而异.需要自己试.
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9楼2013-04-04 13:26:12
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by hudazhangyi at 2013-04-04 10:47:56
不知道你有没有目的蛋白的抗体或买到抗体，做一下亲和层析

目的蛋白是带GST标签的，只是单纯做纯化，没有抗体。
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6楼2013-04-04 11:21:42
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by auroraA at 2013-04-04 13:26:12
70kda的是heatshock,加点ATP就和你的蛋白分开了. 35的不知道是什么.如果比你的蛋白小,可能是降解产物,因为细菌里有点降解,或者纯化过程中的降解很普遍,这根据每个蛋白的性质而异.比如p35这个蛋白,想拿到50%"纯 ...

好的，试试看去。谢谢
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10楼2013-04-04 17:21:06
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by auroraA at 2013-04-04 13:26:12
70kda的是heatshock,加点ATP就和你的蛋白分开了. 35的不知道是什么.如果比你的蛋白小,可能是降解产物,因为细菌里有点降解,或者纯化过程中的降解很普遍,这根据每个蛋白的性质而异.比如p35这个蛋白,想拿到50%"纯 ...

有没有heat shock protein 纯化或者去除的相关资料？为什么推荐ATP？多少浓度比较合适？
谢谢。
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11楼2013-04-08 11:18:01
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遥控器68

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
果断免疫共沉淀嘛
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12楼2013-04-08 17:05:18
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 遥控器68 at 2013-04-08 17:05:18
果断免疫共沉淀嘛

求指导。
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13楼2013-04-08 20:36:25
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遥控器68

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
13楼: Originally posted by dshlove at 2013-04-08 20:36:25
求指导。...

也在学习中呀……
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14楼2013-04-09 08:39:41
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 遥控器68 at 2013-04-09 08:39:41
也在学习中呀……...

是不是还要买抗体？
抗体的东西做的少，了解的不多。
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15楼2013-04-09 09:30:32
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失落的豇豆2楼
2013-04-03 14:08   回复  
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