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biomasterdoc金虫 (正式写手)
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[求助]
【求助】如何探究两个蛋白质之间的直接或间接相互作用？谢谢！
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RT. 细胞内蛋白质之间的直接或间接相互作用，如何探究呢？比如，在转录、翻译或protein-protein interaction 水平上？即A蛋白调节B蛋白的转录、A蛋白调节B蛋白的翻译，或AB直接/间接发生作用。如何设计实验思路呢？ 研一新生，导师安排的任务，现在毫无头绪，特来求助各位大神，谢谢！  |
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凌波丽
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蛋白质之间的相互作用 蛋白质之间的相互作用，我个人认为可能可以从六个角度理解：蛋白质-蛋白质的相互作用，蛋白质-DNA的相互作用，蛋白质-RNA的相互作用，从生物信息学和系统生物学角度研究生物大分子相互作用，研究具体的基因的功能，蛋白质在相互作用过程中的结构改变或重折叠或者去折叠。下面分别简单叙述一下。 蛋白质-蛋白质的相互作用研究技术：酵母双杂交，免疫共沉淀，蛋白质-蛋白质共结晶后X-ray diffraction,NMR,pull-down，质谱（ESI-MS可以用检测蛋白质-蛋白质的相互作用），荧光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-蛋白质的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-蛋白质的相互作用位点，低温冷冻电镜观测等，光镊技术目前尚在研究开发阶段。 蛋白质之间的相互作用如果不是直接相互作用，也可以通过蛋白质-RNA的相互作用和蛋白质-DNA的相互作用而间接产生。 蛋白质-DNA的相互作用：EMSA，足迹法，干扰法，CHIP,DNA-蛋白质共结晶后X-ray diffraction,NMR,pull-down，光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-DNA的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-DNA的相互作用位点，低温冷冻电镜观测，蛋白质-DNA的相互作用的特异作用位点的化学交联等。 蛋白质-RNA的相互作用：EMSA，足迹法，干扰法，RNA-蛋白质共结晶后X-ray diffraction（核糖体大小亚基的晶体结构就是这样测定的）,NMR,pull-down，光共振能量转移，电子晶体学，电子显微镜直接观测，全内反射荧光显微术(TIRFM)，原子力显微镜观测，化学或酶试剂对于蛋白质进行裂解确定蛋白质-RNA的相互作用位点确定，突变（定点突变，结构域转换等）与蛋白质再/去折叠对蛋白质-RNA的相互作用位点，低温冷冻电镜观测，蛋白质-RNA的相互作用的特异作用位点的化学交联等。 另外，可以从生物信息学和系统生物学角度研究生物大分子相互作用，比如可以模拟与预测生物大分子相互作用前后的结构变化推测计算出具体的相互作用位点和构象和能量变化等，生物大分子相互作用在细胞中构成复杂的网络-----比如小世界网络，等级网络，scale-free网络等，可以应用系统生物学的和图论的方法探测出细胞在基因表达的某些方面的相互作用分子体系构成的网络，然后根据网络的抽象的一般特征去研究有关分子间的可能的作用机理和网络整体运行机制。 研究具体的基因的功能也是研究基因表达相互作用的方法。具体我不谈了，我只强调一点：除了基因敲除或敲入，应用蛋白质（比如抗体）亲和作用在细胞内抑制功能蛋白质的功能等降低基因功能的方法外，增强基因功能或者基因异位表达也是研究基因功能的重要方法，非常突出的是iPS cell。 产生诱导多能干细胞的方法 "It(iPS cell) is now possible to reprogram mouse and human somatic cells to a pluripotent state by ectopic expression of the factors OC T4, SOX2, KLF4and c-MYC or a different set of four factors (OCT4, SOX2, NANOG and LIN28 ).Human iPS cells closely resemble ES cells in gene expression, pluripotency and epigenetic states, and hold great potential for regenerative medicine and in v it ro disease modeling. More studies are needed to determine whether iPS cells and ES cells are equivalent in all aspects of function and potential. Retroviral Infection The day before transduction, Plat-E cells (Morita et al., 2000) were seeded at 8X106cells per 100 mm dish. On the next day, pMXs-based retroviral vectors were introduced into Plat-E cells using Fugene 6 transfection reagent (Roche) according to the manufacturer’s recom-mendations. Twenty-seven microliters of Fugene 6 transfection re-agent was diluted in 300 m l DMEM and incubated for 5 min at room tem-perature. Nine micrograms of plasmid DNA was added to the mixture,which was incubated for another 15 min at room temperature. After in-cubation, the DNA/Fugene 6 mixture was added drop by drop onto Plat-E cells. Cells were then incubated overnight at 37 centigrade with 5% CO2 。Twenty-four hours after transduction, the medium was replaced. MEFs or TTFs were seeded at 8X105 cells per 100 mm dish on mito-mycin C-treated STO feeders. After 24 hr, virus-containing superna-tants derived from these Plat-E cultures were filtered through a 0.45 m m cellulose acetate filter (Schleicher & Schuell) and supple-mented with 4mg/ml polybrene (Nacalai Tesque). Target cells were in-cubated in the virus/polybrene-containing supernatants for 4 hr to overnight. After infection, the cells were replated in 10 ml fresh medium. Three days after infection, we added G418 at a final concen-tration of 0.3 mg/ml. Clones were selected for 2 to 3 weeks. The c-Myc protein has many downstream targets that enhance proliferation and transformation (Adhikary and Eilers, 2005), many of which may have roles in the generation of iPS cells. Of note, c-Myc associates with histone acetyltransferase (HAT) complexes, including TRRAP, which is a core subunit of the TIP60 and GCN5 HAT complexes ( McMahon et al., 1998), CREB binding protein (CBP), and p300 ( Vervoorts et al., 2003). Within the mammalian genome, there may be up to 25,000 c-Myc binding sites ( Cawley et al., 2004), many more than the predicted number of Oct3/4 and Sox2 binding sites ( Boyer et al.,2005; Loh et al., 2006 ). c-Myc protein may induce global histone acetylation ( Fernandez et al., 2003 ), thus allowing Oct3/4 and Sox2 to bind to their specific target loci. Klf4 has been shown to repressp53 directly ( Rowland et al., 2005 ), and p53 protein has been shown to suppress Nanog during ES cell differentiation (Lin et al., 2004 ). Kazutoshi Takahashi and Shinya YamanakaInduction found that iPS cells showed levels of p53 protein lower than those in MEFs (Figure 7 A). Thus, Klf4 might contribute to activation ofNanog and other ES cell-specific genes through p53 repression. - Klf4 might function as an inhibitor of c-Myc-induced apoptosis through the repression of p53 in system of Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamana kaInduction。The balance between c-Myc and Klf4 may be important for the generation of iPS cells. Klf4 can both activate and repress transcription. Alternatively, Klf4 might function as an inhibitor of Myc-induced apoptosis through the repression of p53 in our system ( Zindy et al., 1998 ). On the other hand, Klf4 activates p21 CIP1, thereby suppressing cell proliferation ( Zhang et al., 2000 ). This antiproliferation function of Klf4 might be inhibited by c-Myc, which suppresses the expression of p21 CIP1(Seoane et al., 2002 ).The balance between c-Myc and Klf4 may be important for the generation of iPS cells." -------Kazutoshi Takahashi and Shinya Yamanaka,Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors,Cell ,2006, Vol-126 , 663–676. 蛋白质在相互作用过程中的结构改变或重折叠或者去折叠，可用温度跳跃，NMR，差热分析，红外光谱测定二级结构，点突变测定蛋白质的折叠路径与终态改变等。 以前回答一篇基因相互作用的帖子，今天投篮略修改后发上来。具体如何做，看你们实验室实测中基因表达调控还是蛋白质结构与研究，或是生物信息学和系统生物学，或蛋白质折叠等，而决定。 |
3楼2012-04-24 09:57:32
sl35537417
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个人理解 A蛋白调节B蛋白的转录 是指 DNA与蛋白质的相互作用 A蛋白调节B蛋白的翻译 才是蛋白质之间的相互作用 现在来说 研究蛋白互作的方法很多 如果A与B是已确定的两个蛋白 只需验证的话 可以采用酵母双杂交 细菌双杂交 COIP 以及SPR表面等离子共振 如果只知道A或者B 要找到与其有相互作用的蛋白 这样的话 可以采用构建基因组文库 然后双杂交筛选 也可以在A或B蛋白加上tag 纯化 得到的mixture 再过质谱鉴定成分 然后再回过头来 采用双杂交或者coip进一步验证 |
2楼2012-04-24 04:28:55
mamadexiao
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