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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)

[求助] 诱导蛋白表达 SDS-PAGE没有目的条带 已有1人参与

我最近在做基因的原核表达,做的是一种内切木聚糖酶,表达载体为pET28a,宿主细胞为BL21。将菌液摇至OD=0.5-0.7时加0.2mM IPTG诱导  20度 180rpm培养12h、16h、20h、24h。菌体超声波破碎,破碎后离心有很多白色沉淀,上清可以测出酶活。将上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳,上清中没有目的条带,沉淀中有目的条带。沉淀中有目的条带应该是包涵体,但是为什么上清中可以测到酶活却没有目的条带啊?急求各路高手指点!!!
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严以律已,宽以待人
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 海之韵-哈哈 at 2013-12-03 09:01:16
谢谢您的回复,请问有什么方法可以让上清中的目的蛋白条带清晰一些吗?(随着诱导时间的延长,包涵体越多的)...

可以试试降低IPTG浓度,降低诱导温度。也就是让蛋白诱导慢一些,量少一些,形成正确折叠的几率会增加。
7楼2013-12-03 15:42:17
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2013-12-03 09:31:14
这说明你的蛋白大部分形成包涵体了,少部分可溶,在上清。上清里的蛋白是有活性的,所以测出酶活。SDS-PAGE上清没有条带是因为表达蛋白大部分在沉淀,上清里面的目标蛋白少,杂带多。
2楼2013-12-03 05:17:40
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2013-12-03 09:31:22
1.楼上说的有道理,上清有目的条带,只是和其它条带混在一起不那么明显,
2.再者你看看大肠杆菌里是否含有类似的酶,要有阴性对照,即未表达菌株无酶活
星陈代谢
3楼2013-12-03 08:23:02
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by kx444555 at 2013-12-03 08:23:02
1.楼上说的有道理,上清有目的条带,只是和其它条带混在一起不那么明显,
2.再者你看看大肠杆菌里是否含有类似的酶,要有阴性对照,即未表达菌株无酶活

阴性对照在目的条带那里也有一条带,所以跑出来的sds-page条带阴性和阳性的条带差别不大。请问有什么解决办法吗?
严以律已,宽以待人
4楼2013-12-03 08:57:47
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-03 05:17:40
这说明你的蛋白大部分形成包涵体了,少部分可溶,在上清。上清里的蛋白是有活性的,所以测出酶活。SDS-PAGE上清没有条带是因为表达蛋白大部分在沉淀,上清里面的目标蛋白少,杂带多。

谢谢您的回复,请问有什么方法可以让上清中的目的蛋白条带清晰一些吗?(随着诱导时间的延长,包涵体越多的)
严以律已,宽以待人
5楼2013-12-03 09:01:16
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guhousheng

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
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[ 发自小木虫客户端 ]
6楼2013-12-03 09:50:18
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)

嗯  我的酶也是这种情况,希望多交流交流
8楼2013-12-16 21:37:41
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by 稻草人的学习 at 2013-12-16 21:37:41
嗯  我的酶也是这种情况,希望多交流交流

请问你的问题解决了吗?
严以律已,宽以待人
9楼2013-12-18 21:36:52
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by 海之韵-哈哈 at 2013-12-18 21:36:52
请问你的问题解决了吗?...

没有,不知道怎么办哪
10楼2013-12-19 10:40:10
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