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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 诱导蛋白表达 SDS-PAGE没有目的条带
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)

[求助] 诱导蛋白表达 SDS-PAGE没有目的条带已有1人参与

我最近在做基因的原核表达，做的是一种内切木聚糖酶，表达载体为pET28a，宿主细胞为BL21。将菌液摇至OD=0.5-0.7时加0.2mM IPTG诱导  20度 180rpm培养12h、16h、20h、24h。菌体超声波破碎，破碎后离心有很多白色沉淀，上清可以测出酶活。将上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳，上清中没有目的条带，沉淀中有目的条带。沉淀中有目的条带应该是包涵体，但是为什么上清中可以测到酶活却没有目的条带啊？急求各路高手指点！！！
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严以律已，宽以待人
1楼2013-12-02 21:13:56
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 海之韵-哈哈 at 2013-12-03 09:01:16
谢谢您的回复，请问有什么方法可以让上清中的目的蛋白条带清晰一些吗？（随着诱导时间的延长，包涵体越多的）...

可以试试降低IPTG浓度，降低诱导温度。也就是让蛋白诱导慢一些，量少一些，形成正确折叠的几率会增加。
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7楼2013-12-03 15:42:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2013-12-03 09:31:14
这说明你的蛋白大部分形成包涵体了，少部分可溶，在上清。上清里的蛋白是有活性的，所以测出酶活。SDS-PAGE上清没有条带是因为表达蛋白大部分在沉淀，上清里面的目标蛋白少，杂带多。
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2楼2013-12-03 05:17:40
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kx444555

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, 鼓励应助 2013-12-03 09:31:22
1.楼上说的有道理，上清有目的条带，只是和其它条带混在一起不那么明显，
2.再者你看看大肠杆菌里是否含有类似的酶，要有阴性对照，即未表达菌株无酶活
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星陈代谢
3楼2013-12-03 08:23:02
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kx444555 at 2013-12-03 08:23:02
1.楼上说的有道理，上清有目的条带，只是和其它条带混在一起不那么明显，
2.再者你看看大肠杆菌里是否含有类似的酶，要有阴性对照，即未表达菌株无酶活

阴性对照在目的条带那里也有一条带，所以跑出来的sds-page条带阴性和阳性的条带差别不大。请问有什么解决办法吗？
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严以律已，宽以待人
4楼2013-12-03 08:57:47
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-03 05:17:40
这说明你的蛋白大部分形成包涵体了，少部分可溶，在上清。上清里的蛋白是有活性的，所以测出酶活。SDS-PAGE上清没有条带是因为表达蛋白大部分在沉淀，上清里面的目标蛋白少，杂带多。

谢谢您的回复，请问有什么方法可以让上清中的目的蛋白条带清晰一些吗？（随着诱导时间的延长，包涵体越多的）
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严以律已，宽以待人
5楼2013-12-03 09:01:16
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guhousheng

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
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6楼2013-12-03 09:50:18
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
嗯  我的酶也是这种情况，希望多交流交流
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8楼2013-12-16 21:37:41
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海之韵-哈哈

银虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 稻草人的学习 at 2013-12-16 21:37:41
嗯  我的酶也是这种情况，希望多交流交流

请问你的问题解决了吗？
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严以律已，宽以待人
9楼2013-12-18 21:36:52
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稻草人的学习

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 海之韵-哈哈 at 2013-12-18 21:36:52
请问你的问题解决了吗？...

没有，不知道怎么办哪
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10楼2013-12-19 10:40:10
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