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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求指点用IPTG诱连接在pET28a上的蛋白表达
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vpz2007

木虫 (小有名气)

[求助] 求指点用IPTG诱连接在pET28a上的蛋白表达

各位战友，大家好！最近我用IPTG诱导蛋白表达，诱导浓度是0.2mM，0.4mM，0.6mM，0.8mM，分别在28和37度诱导。但是每次都没有在跑电泳时看到有条带了。BL21大肠杆菌中，连接在pET28a上的蛋白是一个自己合成的只有300bp，大约11kD的小蛋白，我现在已经被这个问题弄得焦头烂额了，希望有经验的战友能够提供一点意见，非常感谢！
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
1楼2012-12-11 09:28:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励应助！ 2012-12-11 20:08:06
你上的是全菌蛋白还是可溶蛋白？诱导时间是多少？诱导时菌液的OD是多少？感觉你先不用试那么多IPTG浓度，确定能诱导出来后再优化条件。如果本身不表达的话可能有其它问题存在。首先你是否对克隆载体进行了测序？如果是真核物种的基因，是否含有大肠杆菌的稀有密码子？
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vpz2007
2楼2012-12-11 11:24:04
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vpz2007

木虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-11 11:24:04
你上的是全菌蛋白还是可溶蛋白？诱导时间是多少？诱导时菌液的OD是多少？感觉你先不用试那么多IPTG浓度，确定能诱导出来后再优化条件。如果本身不表达的话可能有其它问题存在。首先你是否对克隆载体进行了测序？如果 ...

是可溶蛋白，诱导前OD0.6前后。我表达的这个蛋白是植物的，是把全蛋白序列截断成三段后取最两边的两段序列连接在一次生工那儿合成，没有稀有密码子。
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
3楼2012-12-11 13:28:23
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

会不会是表达在包涵体里了？先上个全蛋白看看有没有诱导出来。
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4楼2012-12-11 14:38:19
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vpz2007

木虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-11 14:38:19
会不会是表达在包涵体里了？先上个全蛋白看看有没有诱导出来。

全蛋白也没有这个条带，我试过超声破碎菌体也没有发现目的条带，有点发愁
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
5楼2012-12-11 17:12:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

表达的目的蛋白对大肠杆菌有毒吗？要么再查一下看公司合成的序列是不是有问题。
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6楼2012-12-12 07:58:31
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chlorella409

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以试试再降低诱导温度试下，可以到15-20度左右，或者再降低IPTG浓度，这都有利可溶蛋白的表达。
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7楼2012-12-12 08:55:49
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vpz2007

木虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-12-12 07:58:31
表达的目的蛋白对大肠杆菌有毒吗？要么再查一下看公司合成的序列是不是有问题。

序列核对过了。蛋白是膜蛋白，过量积累应该是有害
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可以接受失败，但不能失去再次站起来的勇气
8楼2012-12-12 13:14:07
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sxxuan

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
确定序列对不对，哪怕序列是你当初设定的序列，也要细心检查构建载体的时候有没有移码或什么的，确定你的设计没有任何问题，蛋白才能表达出来。
如果能表达的话，条件不是很好也能诱导的，只是浓度的问题。先从源头看看。
蛋白表达不好弄，试过哪怕什么都可以的，都做不出来。
载体上不是有His吗？看看跑胶后有没有His的条带，这样才能确定你用的载体或试剂有没有问题。
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你的日子如何，你的力量也必如何！
9楼2012-12-12 14:33:51
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zehego

木虫 (小有名气)
11kd  你用什么胶跑的？  15%的胶有时候都不大能看到14kd的marker呢   看下是不是胶的问题了
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10楼2012-12-12 14:45:37
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