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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段连接pET-28a表达载体
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guowei927111

金虫 (小有名气)

[求助] 大片段连接pET-28a表达载体

最近在做一个长6.9kb的目的片段连接pET-28a载体，连了几次没有连上，请问高手们有什么好办法没啊？
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再接再厉
1楼 2012-03-30 21:12:00
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
加大片段浓度，16度过夜连接
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jiayoubashaonian
2楼2012-03-30 22:12:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
做过很多连接，但是最没信心做的就是大片段连接，特别是当片段与载体大小相近，或比片段还大时，这种连接基本都不大敢做。同问，看有没有这方面有经验的虫子。
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Thank-you，so-blue.
3楼2012-03-31 09:32:01
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以适当增加片段的用量和酶的用量试试
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4楼2012-03-31 10:04:37
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
目的片段回收产物 6.5 uL
pET-28a酶切回收产物  1 uL
Solution I  7.5uL
16度 3小时
应该就可以了
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5楼2012-03-31 10:48:55
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guowei927111

金虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by zx6291 at 2012-03-31 10:48:55:
目的片段回收产物 6.5 uL
pET-28a酶切回收产物  1 uL
Solution I  7.5uL
16度 3小时
应该就可以了

你说的SolutionI是连接T载体用的那个吗？
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再接再厉
6楼2012-03-31 10:59:35
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zx6291

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是的，SolutionI为TAKARA公司产品，并不仅用于连接T载体，我们现在做连接都用它，效率比T4连接酶要高。
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7楼2012-03-31 11:27:45
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bffgbgff

新虫 (小有名气)
大片段链接，不能加大浓度，应该减小浓度。当载体和片段大小相近的时候，摩尔比，片段：载体= 1：1 或者1:2，试试吧，good luck !
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8楼2012-03-31 12:40:42
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churchill87426

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
其实觉得Takara的SolutionI和T4效率都一般，不如Promega的T4。个人感觉而已。
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9楼2012-03-31 17:57:32
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