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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
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witeness

新虫 (初入文坛)

[求助] pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。

1.pET28a提出来时分子量就很大，8kb左右，不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大，但双酶切后在5.5kb左右。见电泳图：左边到右分为为：marker（三条亮带分别为6000 3000 1000） 双切后质粒 未酶切的质粒 双切后的目的基因（1.5kb）
2.我用SacI和HindIII双酶切，体系20ul,10*tango buffer 2ul,质粒DNA 16ul,SacI 1ul,HindIII 1ul.切出来的条带在5.5kb左右。目的基因是从T载体上切下来的，20ul体系和质粒双酶切一样，就把质粒DNA换成目的基因16ul.电泳显示是切开了的。37度酶切6小时。
3.10ul的连接体系：目的基因7ul,载体1.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.4度过夜连接，什么也不长，我还设置了对照组，感受态组：什么也不转，长得很好，说明感受态没问题。质粒自连组：质粒 2ul，ddH2O 6.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.什么也不长。双切后的线性质粒转化，5ul的线性质粒转化100ul感受态，也什么都不长。。。
重复好几次了都不长，快崩溃了。。。

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1楼 2013-03-02 09:28:20
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回帖置顶 ( 共有1个 )

witeness

新虫 (初入文坛)
gyesang: 回帖置顶 2013-04-28 17:32:56
我的连接做出来了，在此分享下，希望能帮到遇到同样问题的同学
1.我的质粒提出来大小不对，可能就是构想不同的原因，虽然我前几次提的都是这么大，但有一次我提出来的质粒大小事对的，在5,6k左右。但之前分子量大的质粒不影响后续试验
2.我之前一直连接不上市因为我的片段浓度都太小了，双酶切完跑胶时条带也不是很亮，回收损失一部分就更少了，后来加大上样量，DNA片段浓度提高了，就连上了，虽然就长了两个菌落，但都是阳性的，呵呵，目前不知道为啥连接效率这么低，空质粒转感受态的效率很高，所以应该不会是感受态的问题。希望大侠们帮我分析下原因，接下来还要连第二个基因，不想连接效率还是这么低啊
无论怎样，只要连上就好
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16楼2013-03-07 15:57:07
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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★ ★
感谢参与，应助指数 +1
witeness(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-14 15:31:07
你做了很多对照，但是转化最关键的是需要做一个阳性对照和阴性对照。你把感受态什么都不转，涂的是无抗性的板子吧，否则不能长得很好。这个并不能说明感受态没问题，只能说明感受态细胞复苏得不错。是否具备感受性需要用感受态细胞转一个抗性相同的质粒，能转进去才说明感受态好用，这是我提到的阳性对照。阴性对照应该是感受态什么都不转涂抗性板，说明感受态细胞没有污染，抗性平板筛选压力足够。
我有些不明白你说的质粒自连是什么。质粒肯定可以转进去的，即使加了连接酶什么的，并不影响后面的转化。做这个对照的意义是什么呢？
对于线性载体，有人做这个对照，一般是把双酶切的线性载体自连后转化。如果出现很多克隆，说明酶切不完全。
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witeness
3楼2013-03-02 13:20:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
witeness(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-15 09:49:13
你提的质粒“分子量很大”是质粒的构象问题，你不是用盒子提的吧？你的这种情况，很可能主要是开环构象。
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witeness
4楼2013-03-02 13:22:25
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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witeness(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-14 15:31:24
我建议你对DNA进行定量。
一般来说，设计一个连接反应，载体量最少需要50-100ng，而外源片段的分子数是载体分子数的3-10倍（具体质量取决于你的载体或外源片段的大小，你可以自己换算）。连接体系为10ul，转化时用一半（5ul）转化50ul感受态细胞（最好用购买的感受态细胞，感受态的效率有保证），留下另一半备用。
最好设置各种对照，以方便分析失败的原因，包括空载体连接对照等。
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witeness
9楼2013-03-02 22:47:57
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
witeness(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 17:32:29
引用回帖:
5楼: Originally posted by witeness at 2013-03-02 14:05:00
我之前也做过把空质粒转感受态，在抗性平板上长的很好，说明不是感受态的问题啊。这次提的质粒不够了就没做对照。感觉应该不是感受态的问，因为是刚刚做的，而且以前也是这么做的，效果都很好。
质粒自连就是双切 ...

如果是自己制备的感受态，每次新做一批都要验证一下活性的。此外，酶切及回收的片段做连接最好定量，这样可以保证反应的效率。
通过看你的一系列对照，我觉得你最好看看是不是T4连接酶的问题，试试把载体做单酶切的片段自连后转化，应该有很多克隆才对。
关于质粒的构象，当然超螺旋是最好的，一般用盒子提的话主要是这种构象的。开环的也不是不行，就是分子的一条链上有缺口，你双酶切出来的片段应该可以用的。如果你每次提都是这样的情况确实有些问题。你用盒子提其它质粒的时候有同样的问题吗？
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witeness
10楼2013-03-03 01:15:27
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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不会是抗性搞错了吧
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生活是一面镜子，要笑着面对！
14楼2013-03-03 18:57:38
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普通回帖

piaoyunokok

木虫 (正式写手)
遇到类似的问题，求助啊
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2楼2013-03-02 11:03:32
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witeness

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-02 13:20:24
你做了很多对照，但是转化最关键的是需要做一个阳性对照和阴性对照。你把感受态什么都不转，涂的是无抗性的板子吧，否则不能长得很好。这个并不能说明感受态没问题，只能说明感受态细胞复苏得不错。是否具备感受性需 ...

我之前也做过把空质粒转感受态，在抗性平板上长的很好，说明不是感受态的问题啊。这次提的质粒不够了就没做对照。感觉应该不是感受态的问，因为是刚刚做的，而且以前也是这么做的，效果都很好。
质粒自连就是双切后的线性载体加连接酶，看酶切完全没有。
所以现在不知道问题出现在哪了。。。
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5楼2013-03-02 14:05:00
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witeness

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-02 13:22:25
你提的质粒“分子量很大”是质粒的构象问题，你不是用盒子提的吧？你的这种情况，很可能主要是开环构象。

但我每次提出来的都是这么大，难道都是开环构想？不会这么巧吧，使用生工生物的试剂盒提的。开环构想对后续试验有没有影响？
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6楼2013-03-02 14:08:38
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witeness

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-02 13:22:25
你提的质粒“分子量很大”是质粒的构象问题，你不是用盒子提的吧？你的这种情况，很可能主要是开环构象。

大侠们，快快救我
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7楼2013-03-02 14:10:48
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damaomao

禁虫 (正式写手)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
8楼2013-03-02 16:47:07
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