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pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
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1.pET28a提出来时分子量就很大，8kb左右，不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大，但双酶切后在5.5kb左右。见电泳图：左边到右分为为：marker（三条亮带分别为6000 3000 1000） 双切后质粒 未酶切的质粒 双切后的目的基因（1.5kb） 2.我用SacI和HindIII双酶切，体系20ul,10*tango buffer 2ul,质粒DNA 16ul,SacI 1ul,HindIII 1ul.切出来的条带在5.5kb左右。目的基因是从T载体上切下来的，20ul体系和质粒双酶切一样，就把质粒DNA换成目的基因16ul.电泳显示是切开了的。37度酶切6小时。 3.10ul的连接体系：目的基因7ul,载体1.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.4度过夜连接，什么也不长，我还设置了对照组，感受态组：什么也不转，长得很好，说明感受态没问题。质粒自连组：质粒 2ul，ddH2O 6.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.什么也不长。双切后的线性质粒转化，5ul的线性质粒转化100ul感受态，也什么都不长。。。 重复好几次了都不长，快崩溃了。。。  101_0045.JPG |
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gyesang: 回帖置顶 2013-04-28 17:32:56
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我的连接做出来了，在此分享下，希望能帮到遇到同样问题的同学 1.我的质粒提出来大小不对，可能就是构想不同的原因，虽然我前几次提的都是这么大，但有一次我提出来的质粒大小事对的，在5,6k左右。但之前分子量大的质粒不影响后续试验 2.我之前一直连接不上市因为我的片段浓度都太小了，双酶切完跑胶时条带也不是很亮，回收损失一部分就更少了，后来加大上样量，DNA片段浓度提高了，就连上了，虽然就长了两个菌落，但都是阳性的，呵呵，目前不知道为啥连接效率这么低，空质粒转感受态的效率很高，所以应该不会是感受态的问题。希望大侠们帮我分析下原因，接下来还要连第二个基因，不想连接效率还是这么低啊 无论怎样，只要连上就好 |
16楼2013-03-07 15:57:07
cicelyzh
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你做了很多对照，但是转化最关键的是需要做一个阳性对照和阴性对照。你把感受态什么都不转，涂的是无抗性的板子吧，否则不能长得很好。这个并不能说明感受态没问题，只能说明感受态细胞复苏得不错。是否具备感受性需要用感受态细胞转一个抗性相同的质粒，能转进去才说明感受态好用，这是我提到的阳性对照。阴性对照应该是感受态什么都不转涂抗性板，说明感受态细胞没有污染，抗性平板筛选压力足够。 我有些不明白你说的质粒自连是什么。质粒肯定可以转进去的，即使加了连接酶什么的，并不影响后面的转化。做这个对照的意义是什么呢？ 对于线性载体，有人做这个对照，一般是把双酶切的线性载体自连后转化。如果出现很多克隆，说明酶切不完全。 |
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witeness3楼2013-03-02 13:20:24
cicelyzh
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我建议你对DNA进行定量。 一般来说，设计一个连接反应，载体量最少需要50-100ng，而外源片段的分子数是载体分子数的3-10倍（具体质量取决于你的载体或外源片段的大小，你可以自己换算）。连接体系为10ul，转化时用一半（5ul）转化50ul感受态细胞（最好用购买的感受态细胞，感受态的效率有保证），留下另一半备用。 最好设置各种对照，以方便分析失败的原因，包括空载体连接对照等。 |
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9楼2013-03-02 22:47:57
cicelyzh
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如果是自己制备的感受态，每次新做一批都要验证一下活性的。此外，酶切及回收的片段做连接最好定量，这样可以保证反应的效率。 通过看你的一系列对照，我觉得你最好看看是不是T4连接酶的问题，试试把载体做单酶切的片段自连后转化，应该有很多克隆才对。 关于质粒的构象，当然超螺旋是最好的，一般用盒子提的话主要是这种构象的。开环的也不是不行，就是分子的一条链上有缺口，你双酶切出来的片段应该可以用的。如果你每次提都是这样的情况确实有些问题。你用盒子提其它质粒的时候有同样的问题吗？ |
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10楼2013-03-03 01:15:27
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