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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
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witeness

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
9楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-03-02 22:47:57
我建议你对DNA进行定量。
一般来说，设计一个连接反应，载体量最少需要50-100ng，而外源片段的分子数是载体分子数的3-10倍（具体质量取决于你的载体或外源片段的大小，你可以自己换算）。连接体系为10ul，转化时用 ...

定量是在双酶切完了胶回收之后进行定量吗？
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11楼2013-03-03 10:08:59
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witeness

新虫 (初入文坛)
送鲜花一朵
引用回帖:
10楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-03 01:15:27
如果是自己制备的感受态，每次新做一批都要验证一下活性的。此外，酶切及回收的片段做连接最好定量，这样可以保证反应的效率。
通过看你的一系列对照，我觉得你最好看看是不是T4连接酶的问题，试试把载体做单酶切 ...

连接酶应该没问题，刚买的，而且别人用好好地，我准备定量DNA的浓度试试，谢谢谢谢
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12楼2013-03-03 10:10:27
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studentg

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得应该目的基因是没有连接到载体上，要是连上了总会有东西，有时候甚至连对照都不用做。
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道法自然，探其精妙。
13楼2013-03-03 10:22:38
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小小技术官

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不会是抗性搞错了吧
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生活是一面镜子，要笑着面对！
14楼2013-03-03 18:57:38
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铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
witeness(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 17:32:54
1.空质粒提取出来应该是5000多一点，你的质粒是不是存在问题。2、你的对照并不能说明感受态细胞是否有问题，是不是感受态细胞做坏了。3、看看你的抗性是否有问题，是不是配错了或者是浓度加大了，卡那霉素应该是50ug/ml工作浓度（相对于pet28a）。
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15楼2013-03-04 21:33:39
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witeness

新虫 (初入文坛)
gyesang: 回帖置顶 2013-04-28 17:32:56
我的连接做出来了，在此分享下，希望能帮到遇到同样问题的同学
1.我的质粒提出来大小不对，可能就是构想不同的原因，虽然我前几次提的都是这么大，但有一次我提出来的质粒大小事对的，在5,6k左右。但之前分子量大的质粒不影响后续试验
2.我之前一直连接不上市因为我的片段浓度都太小了，双酶切完跑胶时条带也不是很亮，回收损失一部分就更少了，后来加大上样量，DNA片段浓度提高了，就连上了，虽然就长了两个菌落，但都是阳性的，呵呵，目前不知道为啥连接效率这么低，空质粒转感受态的效率很高，所以应该不会是感受态的问题。希望大侠们帮我分析下原因，接下来还要连第二个基因，不想连接效率还是这么低啊
无论怎样，只要连上就好
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16楼2013-03-07 15:57:07
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victory8737

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by witeness at 2013-03-02 14:10:48
大侠们，快快救我...

我现在也在使用pET-28a载体。发现抽屉出来的质粒不是三条带，而是一条，双酶切后的质粒片段电泳位置反而比没有酶切的片段小，是怎么回事呢？
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17楼2013-04-12 09:07:36
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bolysu

禁虫 (著名写手)
本帖内容被屏蔽
18楼2013-04-14 14:55:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
witeness(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖交流经验！ 2013-04-28 17:33:16
引用回帖:
5楼: Originally posted by witeness at 2013-03-02 14:05:00
我之前也做过把空质粒转感受态，在抗性平板上长的很好，说明不是感受态的问题啊。这次提的质粒不够了就没做对照。感觉应该不是感受态的问，因为是刚刚做的，而且以前也是这么做的，效果都很好。
质粒自连就是双切 ...

其实用质粒转化感受态的效率是非常高的，一般只需要用枪头沾一下就可以的。不放心的话，可以吸取移液器最小量程（一般是零点几微升）。如果感受态细胞没有问题，我觉得你试试换一下连接酶。
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19楼2013-04-15 00:07:07
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hxd_715

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
16楼: Originally posted by witeness at 2013-03-07 15:57:07
我的连接做出来了，在此分享下，希望能帮到遇到同样问题的同学
1.我的质粒提出来大小不对，可能就是构想不同的原因，虽然我前几次提的都是这么大，但有一次我提出来的质粒大小事对的，在5,6k左右。但之前分子量大的 ...

您好！我现在也在做PET28a的连接实验，请问一下您：你的目的片段和载体连接以后，转化的感受态是那种？还有转板以后多长时间长出的菌落？非常感谢！！！我的目的片段2KB左右，用的感受态是DH5α，转化以后2天才长出菌落，大概有十几个，摇菌准备提质粒验证，但是摇菌摇不起来，是因为目的片段太长，表达很慢的原因吗？非常期待您的回复！！谢谢！！！
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20楼2013-12-02 15:06:07
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