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321原上草123

新虫 (初入文坛)

你看一下pET28的图谱,SacI和HindIII的酶切位点是挨着的,这样双酶切基本上切不开,因为中间没有足够数量的保护碱基,空间位阻和其他因素会使一种酶失去作用。建议分步酶切。酶切时去磷酸化,以防止载体自连,另外连接前50℃,30min,冰上5min后连接,防止载体自连,然后连接。目的片段很少也能连接。
21楼2013-12-29 17:58:15
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1362544291

新虫 (初入文坛)

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20楼: Originally posted by hxd_715 at 2013-12-02 15:06:07
您好!我现在也在做PET28a的连接实验,请问一下您:你的目的片段和载体连接以后,转化的感受态是那种?还有转板以后多长时间长出的菌落?非常感谢!!!我的目的片段2KB左右,用的感受态是DH5α,转化以后2天才长出 ...

2天才长出菌落不能要了,肯定是杂菌,没有摇起来是给你省事了,不用提质粒,我碰到板子18h长起来,挑菌后也可摇起来,但就是提不出质粒,加溶液III后没见絮状沉淀!直接一片浑浊!
能DH5a 2-16h就可以挑菌了!
22楼2015-08-31 21:46:45
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新虫 (初入文坛)

引用回帖:
21楼: Originally posted by 321原上草123 at 2013-12-29 17:58:15
你看一下pET28的图谱,SacI和HindIII的酶切位点是挨着的,这样双酶切基本上切不开,因为中间没有足够数量的保护碱基,空间位阻和其他因素会使一种酶失去作用。建议分步酶切。酶切时去磷酸化,以防止载体自连,另外连 ...

能切开,不然载体图谱不会这样设计!我做过相邻酶切位点的双酶切,分步酶切就ok了!也不用去磷酸化!阳性概率是80%,我挑10个菌落pcr8个对,其中选3个提质粒双酶切都对!
23楼2015-08-31 21:50:33
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1362544291

新虫 (初入文坛)

做不出来时再多对照都没有!能做出来根本不用这么多对照!从头开始吧~
24楼2015-08-31 21:52:22
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