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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
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321原上草123

新虫 (初入文坛)
你看一下pET28的图谱，SacI和HindIII的酶切位点是挨着的，这样双酶切基本上切不开，因为中间没有足够数量的保护碱基，空间位阻和其他因素会使一种酶失去作用。建议分步酶切。酶切时去磷酸化，以防止载体自连，另外连接前50℃，30min,冰上5min后连接，防止载体自连，然后连接。目的片段很少也能连接。
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21楼2013-12-29 17:58:15
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1362544291

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
20楼: Originally posted by hxd_715 at 2013-12-02 15:06:07
您好！我现在也在做PET28a的连接实验，请问一下您：你的目的片段和载体连接以后，转化的感受态是那种？还有转板以后多长时间长出的菌落？非常感谢！！！我的目的片段2KB左右，用的感受态是DH5α，转化以后2天才长出 ...

2天才长出菌落不能要了，肯定是杂菌，没有摇起来是给你省事了，不用提质粒，我碰到板子18h长起来，挑菌后也可摇起来，但就是提不出质粒，加溶液III后没见絮状沉淀！直接一片浑浊！
能DH5a 2-16h就可以挑菌了！
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22楼2015-08-31 21:46:45
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1362544291

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
21楼: Originally posted by 321原上草123 at 2013-12-29 17:58:15
你看一下pET28的图谱，SacI和HindIII的酶切位点是挨着的，这样双酶切基本上切不开，因为中间没有足够数量的保护碱基，空间位阻和其他因素会使一种酶失去作用。建议分步酶切。酶切时去磷酸化，以防止载体自连，另外连 ...

能切开，不然载体图谱不会这样设计！我做过相邻酶切位点的双酶切，分步酶切就ok了！也不用去磷酸化！阳性概率是80%，我挑10个菌落pcr8个对，其中选3个提质粒双酶切都对！
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23楼2015-08-31 21:50:33
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1362544291

新虫 (初入文坛)
做不出来时再多对照都没有！能做出来根本不用这么多对照！从头开始吧~
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24楼2015-08-31 21:52:22
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