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pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
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1.pET28a提出来时分子量就很大，8kb左右，不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大，但双酶切后在5.5kb左右。见电泳图：左边到右分为为：marker（三条亮带分别为6000 3000 1000） 双切后质粒 未酶切的质粒 双切后的目的基因（1.5kb） 2.我用SacI和HindIII双酶切，体系20ul,10*tango buffer 2ul,质粒DNA 16ul,SacI 1ul,HindIII 1ul.切出来的条带在5.5kb左右。目的基因是从T载体上切下来的，20ul体系和质粒双酶切一样，就把质粒DNA换成目的基因16ul.电泳显示是切开了的。37度酶切6小时。 3.10ul的连接体系：目的基因7ul,载体1.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.4度过夜连接，什么也不长，我还设置了对照组，感受态组：什么也不转，长得很好，说明感受态没问题。质粒自连组：质粒 2ul，ddH2O 6.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.什么也不长。双切后的线性质粒转化，5ul的线性质粒转化100ul感受态，也什么都不长。。。 重复好几次了都不长，快崩溃了。。。  101_0045.JPG |
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17楼2013-04-12 09:07:36