| 查看: 4729 | 回复: 23 | ||||
[求助]
pET28a双酶切后连接目的基因，什么也不长。。。
|
||||
|
1.pET28a提出来时分子量就很大，8kb左右，不知道为什么提出来的质粒分子量就狠大，但双酶切后在5.5kb左右。见电泳图：左边到右分为为：marker（三条亮带分别为6000 3000 1000） 双切后质粒 未酶切的质粒 双切后的目的基因（1.5kb） 2.我用SacI和HindIII双酶切，体系20ul,10*tango buffer 2ul,质粒DNA 16ul,SacI 1ul,HindIII 1ul.切出来的条带在5.5kb左右。目的基因是从T载体上切下来的，20ul体系和质粒双酶切一样，就把质粒DNA换成目的基因16ul.电泳显示是切开了的。37度酶切6小时。 3.10ul的连接体系：目的基因7ul,载体1.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.4度过夜连接，什么也不长，我还设置了对照组，感受态组：什么也不转，长得很好，说明感受态没问题。质粒自连组：质粒 2ul，ddH2O 6.5ul,10*buffer 1ul,T4连接酶 0.5ul.什么也不长。双切后的线性质粒转化，5ul的线性质粒转化100ul感受态，也什么都不长。。。 重复好几次了都不长，快崩溃了。。。  101_0045.JPG |
回复此楼» 收录本帖的淘帖专辑推荐
 实验求助 |
» 猜你喜欢
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有171人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- pET28a与目的基因连接后转化长满菌
已经有9人回复
- 转化子太多假阳性，怎么办呀？
已经有11人回复
- 目的片段和pMD18-T simple vector 的连接
已经有20人回复
- PET-30a 双酶切
已经有4人回复
- 双酶切后目的条带的疑问？
已经有8人回复
- 双酶切后载体片段变小
已经有8人回复
- 长片段连接问题
已经有12人回复
- 连接产物双酶切
已经有11人回复
- PET-32a双酶切无法回收
已经有8人回复
- 双酶切粘性末端连接不上
已经有21人回复
- 构建pBI121表达载体，目的基因与载体连接不上
已经有54人回复
- 目的片段与表达载体的连接
已经有23人回复
- 将质粒上紧挨着的两个酶切位点进行双酶切后连接外源基因片段，是不是不好连接？
已经有13人回复
- 双酶切，体系，切不出来
已经有10人回复
- 目的基因连接pGEX-6p-1进行转化的问题
已经有14人回复
- 求助 双酶切验证阳性克隆的问题
已经有12人回复
- 双酶切连接表达载体，两个月都没做出来，问题到底出在哪里呢~？求指点
已经有52人回复
- 纯化后酶切产物的保存
已经有10人回复
- 【求助/交流】目的基因与pPIC9K连接的问题！
已经有9人回复
- 【求助/交流】连接表达载体PET-28A失败原因
已经有23人回复
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
witeness(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-14 15:31:07
感谢参与，应助指数 +1
witeness(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-14 15:31:07
|
你做了很多对照，但是转化最关键的是需要做一个阳性对照和阴性对照。你把感受态什么都不转，涂的是无抗性的板子吧，否则不能长得很好。这个并不能说明感受态没问题，只能说明感受态细胞复苏得不错。是否具备感受性需要用感受态细胞转一个抗性相同的质粒，能转进去才说明感受态好用，这是我提到的阳性对照。阴性对照应该是感受态什么都不转涂抗性板，说明感受态细胞没有污染，抗性平板筛选压力足够。 我有些不明白你说的质粒自连是什么。质粒肯定可以转进去的，即使加了连接酶什么的，并不影响后面的转化。做这个对照的意义是什么呢？ 对于线性载体，有人做这个对照，一般是把双酶切的线性载体自连后转化。如果出现很多克隆，说明酶切不完全。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
witeness3楼2013-03-02 13:20:24
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
4楼2013-03-02 13:22:25
酶切专家
金虫 (小有名气)
- MolEPI: 2
- 应助: 96 (初中生)
- 金币: 1610.8
- 红花: 4
- 帖子: 149
- 在线: 41.3小时
- 虫号: 1648414
- 注册: 2012-02-27
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
【答案】应助回帖
★ ★
感谢参与，应助指数 +1
witeness(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-14 15:31:24
感谢参与，应助指数 +1
witeness(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天 2013-04-14 15:31:24
|
我建议你对DNA进行定量。 一般来说，设计一个连接反应，载体量最少需要50-100ng，而外源片段的分子数是载体分子数的3-10倍（具体质量取决于你的载体或外源片段的大小，你可以自己换算）。连接体系为10ul，转化时用一半（5ul）转化50ul感受态细胞（最好用购买的感受态细胞，感受态的效率有保证），留下另一半备用。 最好设置各种对照，以方便分析失败的原因，包括空载体连接对照等。 |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
9楼2013-03-02 22:47:57
cicelyzh
铁杆木虫 (职业作家)
- MolEPI: 10
- 应助: 1662 (讲师)
- 金币: 8693.8
- 红花: 72
- 帖子: 3516
- 在线: 456小时
- 虫号: 1614001
- 注册: 2012-02-13
- 专业: 生物化学
【答案】应助回帖
★
witeness(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 17:32:29
witeness(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-04-28 17:32:29
|
如果是自己制备的感受态，每次新做一批都要验证一下活性的。此外，酶切及回收的片段做连接最好定量，这样可以保证反应的效率。 通过看你的一系列对照，我觉得你最好看看是不是T4连接酶的问题，试试把载体做单酶切的片段自连后转化，应该有很多克隆才对。 关于质粒的构象，当然超螺旋是最好的，一般用盒子提的话主要是这种构象的。开环的也不是不行，就是分子的一条链上有缺口，你双酶切出来的片段应该可以用的。如果你每次提都是这样的情况确实有些问题。你用盒子提其它质粒的时候有同样的问题吗？ |
» 本帖已获得的红花（最新10朵）
10楼2013-03-03 01:15:27
小小技术官
木虫 (正式写手)
- 应助: 39 (小学生)
- 金币: 4529.4
- 散金: 248
- 红花: 6
- 帖子: 768
- 在线: 232.5小时
- 虫号: 1972611
- 注册: 2012-09-04
- 性别: GG
- 专业: 常微分方程与动力系统
14楼2013-03-03 18:57:38
piaoyunokok
木虫 (正式写手)
- 应助: 25 (小学生)
- 金币: 3171.1
- 散金: 10
- 红花: 2
- 帖子: 704
- 在线: 116.6小时
- 虫号: 880952
- 注册: 2009-10-22
- 专业: 检验医学
2楼2013-03-02 11:03:32
5楼2013-03-02 14:05:00
6楼2013-03-02 14:08:38
7楼2013-03-02 14:10:48
感谢参与，应助指数 +1
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2013-03-02 16:47:07
投票:
