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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转化子太多假阳性，怎么办呀？
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cdmmore

铜虫 (小有名气)

[求助] 转化子太多假阳性，怎么办呀？

我用Nde1和Xho1双酶切pET28a和目的基因，连接转化后验证了15个转化子，都是空载体。1、还要不要继续验证呀？2、我两种酶是同时加的，同步酶切，这样有没有什么问题？3、为何会出现那么多空载体呀，怎么办？
先谢谢各位大侠啦！
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1楼 2013-01-03 13:35:42
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2013-01-03 16:30:17
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-01-07 17:07:10
如果空载体很多，说明酶切有问题才连不上的。我觉得最好不要再验证了，从新酶切连接转化。
首先你要确定两个酶都是工作的。分别单切载体都能完全切开。
我也用NdeI做克隆，第一次也没有出。以我个人的经验，所有这些普通的克隆应该是one shot就差不多的。NdeI活性很强，时间稍长就会切过，酶也不要加多。我觉得你可以先不加NdeI切XhoI, 觉得切开了再加NdeI切20-30分钟就可以了。
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2楼2013-01-03 14:37:35
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-03 14:37:35
如果空载体很多，说明酶切有问题才连不上的。我觉得最好不要再验证了，从新酶切连接转化。
首先你要确定两个酶都是工作的。分别单切载体都能完全切开。
我也用NdeI做克隆，第一次也没有出。以我个人的经验，所有这 ...

谢谢这位高手的建议，下次这样试试。另外请教一下one shot是什么意思呀？
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3楼2013-01-03 16:32:57
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egaoxy

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助 2013-01-03 23:07:45
他的意思应该是没有星号活性吧
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4楼2013-01-03 21:22:50
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-01-03 22:06:24
说明你pET28a的酶切不完全
所以转化出的大多是空的
减少空载体的量 确保酶切时间
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5楼2013-01-03 21:50:01
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by egaoxy at 2013-01-03 21:22:50
他的意思应该是没有星号活性吧

还是不太明白，也就是说克隆时没有星号活性就差不多了吗？就不怕酶切不完全吗
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6楼2013-01-03 23:07:32
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★有帮助, 谢谢 2013-01-04 10:30:01
推荐使用double digestion designer, 专门用于双酶切设计，可以精确计算酶切时所需的酶量，还可以推荐双酶切buffer，防止出现星活性。可以免费试用。小木虫推荐过，你可以找找，祝好运
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7楼2013-01-03 23:33:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by cdmmore at 2013-01-03 16:32:57
谢谢这位高手的建议，下次这样试试。另外请教一下one shot是什么意思呀？...

one shot就是一次成功呗。祝实验顺利。
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8楼2013-01-04 07:55:53
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chenyuqin

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
cdmmore: 金币+1, ★★★很有帮助, 谢谢 2013-01-04 12:56:02
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-07 17:07:32
我想有两个问题吧：首先是酶切不完全，在确保内切酶好使的情况下，LZ可以减少质粒量，最好在酶切之前先把质粒高温煮2分钟然后冰浴使质粒变性；其次连接时掌握好大片段小片段的比例。
祝LZ好运！
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where there is a will,there ia a way.
9楼2013-01-04 09:31:27
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cdmmore

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-04 07:55:53
one shot就是一次成功呗。祝实验顺利。...

呵呵，谢谢
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10楼2013-01-04 10:30:54
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