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cdmmore

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[求助] 转化子太多假阳性，怎么办呀？

我用Nde1和Xho1双酶切pET28a和目的基因，连接转化后验证了15个转化子，都是空载体。1、还要不要继续验证呀？2、我两种酶是同时加的，同步酶切，这样有没有什么问题？3、为何会出现那么多空载体呀，怎么办？
先谢谢各位大侠啦！

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1楼2013-01-03 13:35:42

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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cdmmore: 金币+3, ★★★很有帮助, 谢谢！ 2013-01-03 16:30:17
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-01-07 17:07:10

如果空载体很多，说明酶切有问题才连不上的。我觉得最好不要再验证了，从新酶切连接转化。
首先你要确定两个酶都是工作的。分别单切载体都能完全切开。
我也用NdeI做克隆，第一次也没有出。以我个人的经验，所有这些普通的克隆应该是one shot就差不多的。NdeI活性很强，时间稍长就会切过，酶也不要加多。我觉得你可以先不加NdeI切XhoI, 觉得切开了再加NdeI切20-30分钟就可以了。

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2楼2013-01-03 14:37:35

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cdmmore

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引用回帖:

2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-03 14:37:35
如果空载体很多，说明酶切有问题才连不上的。我觉得最好不要再验证了，从新酶切连接转化。
首先你要确定两个酶都是工作的。分别单切载体都能完全切开。
我也用NdeI做克隆，第一次也没有出。以我个人的经验，所有这 ...

谢谢这位高手的建议，下次这样试试。另外请教一下one shot是什么意思呀？

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3楼2013-01-03 16:32:57

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