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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » Fosmid文库大片段的阳性克隆子筛选和测序问题
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handsome1984

铁虫 (小有名气)

[求助] Fosmid文库大片段的阳性克隆子筛选和测序问题

大家好，有人构建过Fosmid大片段约40Kb左右的基因组文库吗？筛选阳性克隆可以用特异性引物PCR筛选吗？另外测序是怎么测呢？是提取质粒DNA直接测？片段太大了，好像测不了啊。
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1楼 2012-10-13 14:31:56
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我就做宏基因组学的，构建过十几个Fosmid文库吧
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
4楼2012-10-15 18:44:02
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普通回帖

药剂缘分天空

新虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
scelab: 应助指数-1, 应助指数 -1.禁止恶意应助 2012-10-13 15:51:27
不管怎样，抢个沙发。。。。。。
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2楼2012-10-13 15:44:45
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hippo_li

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你所谓的阳性克隆是指什么呢？是指含有你目的基因片段的克隆？如果是，那当然可以用目的基因的特异性引物进行筛选。
这个测序不是用常规引物测序的，要用类似测基因组序列的测序方法，例如鸟枪法或者454等。你跟测序公司联系，他们会告诉你，一般送要测序的克隆的菌液就可以。
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3楼2012-10-14 19:29:45
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

筛到阳性克隆后还要进一步构建亚克隆文库，再去测序
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
5楼2012-10-15 18:44:57
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小白的桥段

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-15 18:44:02
我就做宏基因组学的，构建过十几个Fosmid文库吧

你建了十几个文库啦，求指导哇，我建了俩，平板涂布后菌株都不长的，到底怎么回事呢？我想如果连接有问题总该长个阴性克隆的啊，我推测包装出问题，可是又想不通什么问题，按照说明做的。
请指教，谢谢。
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6楼2012-11-16 10:43:19
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 小白的桥段 at 2012-11-16 10:43:19
你建了十几个文库啦，求指导哇，我建了俩，平板涂布后菌株都不长的，到底怎么回事呢？我想如果连接有问题总该长个阴性克隆的啊，我推测包装出问题，可是又想不通什么问题，按照说明做的。
请指教，谢谢。...

你提取的DNA质量很重要的，片段尽量大，且尽量去除里面的腐殖酸杂质，提DNA的试剂盒买好点的，提完之后DNA进行乙醇沉淀一次（进一步洗脱杂质和浓缩DNA），操作过程注意些
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7楼2012-11-16 19:15:30
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小白的桥段

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-11-16 19:15:30
你提取的DNA质量很重要的，片段尽量大，且尽量去除里面的腐殖酸杂质，提DNA的试剂盒买好点的，提完之后DNA进行乙醇沉淀一次（进一步洗脱杂质和浓缩DNA），操作过程注意些...

非常感谢回复。我还有一下疑问请教：
我的DNA是提取后用低熔点琼脂糖纯化过一次，用DNA浓度测定仪检测浓度为5000ng/ul，A260/A280=2.072, A260/A230=2.423，这个参数应该是可以的吧。DNA的大小>40kb，我没有大的Marker，用试剂盒带的conrtrol DNA和λ/Hind III 做的marker，有图片。条带从左到右分别是：λ/Hind III （15ul），conrtrol DNA（2.5ul），未剪切样品，剪切500次样品。后面两个是师妹的，片段比我的小。胶破损了，所以有那个长长的亮带。
问题来了，普通的λ/Hind III 可以用来做脉冲吗？总感觉23K的那条带和conrtrol DNA离得太近了。我的片段这么大的，不做剪切直接补平可以吗？上次做的时候还做了切胶回收，从23K带的上边缘切到conrtrol DNA带的上边缘。我看您说片段越大越好，那您的意思是不用切胶回收也可以的吗？
平板涂布后第三天菌落才长出来。据说氯霉素要皮实些不会很快失效，请问一般在37度能维持几天呢？我用原液做的宿主侵染，比率也扩大一倍，用了20ul，最后得到了大约900多个克隆。
侵染后浓度滴定实验时，用不同的稀释浓度涂布，生长状况差不多，10的负1次方和10的负5次方生长的菌落数相差不大，30-50个左右。
以上就是目前碰到的一些问题，说的多，不知道您能不能看明白，还请您不吝赐教。多谢。

11.9脉冲.jpg
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8楼2012-11-21 10:37:06
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

我以前做过Fosmid文库构建，你提取的DNA用来构建文库是不行的，做一下纯化，或者直接就改进一下提取方法
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9楼2012-11-21 12:24:15
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小白的桥段

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
9楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-21 12:24:15
我以前做过Fosmid文库构建，你提取的DNA用来构建文库是不行的，做一下纯化，或者直接就改进一下提取方法

呃，请问是说我的DNA吗？为什么不行？不纯吗？要达到什么条件才算行呢？
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10楼2012-11-21 15:09:08
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