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handsome1984铁虫 (小有名气)
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Fosmid文库大片段的阳性克隆子筛选和测序问题
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| 大家好，有人构建过Fosmid大片段约40Kb左右的基因组文库吗？筛选阳性克隆可以用特异性引物PCR筛选吗？另外测序是怎么测呢？是提取质粒DNA直接测？片段太大了，好像测不了啊。 |
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jinpeng_6118
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jinpeng_6118
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jinpeng_6118
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7楼2012-11-16 19:15:30
【答案】应助回帖
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非常感谢回复。我还有一下疑问请教： 我的DNA是提取后用低熔点琼脂糖纯化过一次，用DNA浓度测定仪检测浓度为5000ng/ul，A260/A280=2.072, A260/A230=2.423，这个参数应该是可以的吧。DNA的大小>40kb，我没有大的Marker，用试剂盒带的conrtrol DNA和λ/Hind III 做的marker，有图片。条带从左到右分别是：λ/Hind III （15ul），conrtrol DNA（2.5ul），未剪切样品，剪切500次样品。后面两个是师妹的，片段比我的小。胶破损了，所以有那个长长的亮带。 问题来了，普通的λ/Hind III 可以用来做脉冲吗？总感觉23K的那条带和conrtrol DNA离得太近了。我的片段这么大的，不做剪切直接补平可以吗？上次做的时候还做了切胶回收，从23K带的上边缘切到conrtrol DNA带的上边缘。我看您说片段越大越好，那您的意思是不用切胶回收也可以的吗？ 平板涂布后第三天菌落才长出来。据说氯霉素要皮实些不会很快失效，请问一般在37度能维持几天呢？我用原液做的宿主侵染，比率也扩大一倍，用了20ul，最后得到了大约900多个克隆。 侵染后浓度滴定实验时，用不同的稀释浓度涂布，生长状况差不多，10的负1次方和10的负5次方生长的菌落数相差不大，30-50个左右。 以上就是目前碰到的一些问题，说的多，不知道您能不能看明白，还请您不吝赐教。多谢。  11.9脉冲.jpg |
8楼2012-11-21 10:37:06
9楼2012-11-21 12:24:15
10楼2012-11-21 15:09:08
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