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handsome1984

铁虫 (小有名气)

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[求助] Fosmid文库大片段的阳性克隆子筛选和测序问题

大家好，有人构建过Fosmid大片段约40Kb左右的基因组文库吗？筛选阳性克隆可以用特异性引物PCR筛选吗？另外测序是怎么测呢？是提取质粒DNA直接测？片段太大了，好像测不了啊。

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1楼2012-10-13 14:31:56

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小白的桥段

新虫 (初入文坛)

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4楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-15 18:44:02
我就做宏基因组学的，构建过十几个Fosmid文库吧

你建了十几个文库啦，求指导哇，我建了俩，平板涂布后菌株都不长的，到底怎么回事呢？我想如果连接有问题总该长个阴性克隆的啊，我推测包装出问题，可是又想不通什么问题，按照说明做的。
请指教，谢谢。

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6楼2012-11-16 10:43:19

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小白的桥段

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【答案】应助回帖

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7楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-11-16 19:15:30
你提取的DNA质量很重要的，片段尽量大，且尽量去除里面的腐殖酸杂质，提DNA的试剂盒买好点的，提完之后DNA进行乙醇沉淀一次（进一步洗脱杂质和浓缩DNA），操作过程注意些...

非常感谢回复。我还有一下疑问请教：
我的DNA是提取后用低熔点琼脂糖纯化过一次，用DNA浓度测定仪检测浓度为5000ng/ul，A260/A280=2.072, A260/A230=2.423，这个参数应该是可以的吧。DNA的大小>40kb，我没有大的Marker，用试剂盒带的conrtrol DNA和λ/Hind III 做的marker，有图片。条带从左到右分别是：λ/Hind III （15ul），conrtrol DNA（2.5ul），未剪切样品，剪切500次样品。后面两个是师妹的，片段比我的小。胶破损了，所以有那个长长的亮带。
问题来了，普通的λ/Hind III 可以用来做脉冲吗？总感觉23K的那条带和conrtrol DNA离得太近了。我的片段这么大的，不做剪切直接补平可以吗？上次做的时候还做了切胶回收，从23K带的上边缘切到conrtrol DNA带的上边缘。我看您说片段越大越好，那您的意思是不用切胶回收也可以的吗？
平板涂布后第三天菌落才长出来。据说氯霉素要皮实些不会很快失效，请问一般在37度能维持几天呢？我用原液做的宿主侵染，比率也扩大一倍，用了20ul，最后得到了大约900多个克隆。
侵染后浓度滴定实验时，用不同的稀释浓度涂布，生长状况差不多，10的负1次方和10的负5次方生长的菌落数相差不大，30-50个左右。
以上就是目前碰到的一些问题，说的多，不知道您能不能看明白，还请您不吝赐教。多谢。

11.9脉冲.jpg

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8楼2012-11-21 10:37:06

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