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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » Fosmid文库大片段的阳性克隆子筛选和测序问题
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
10楼: Originally posted by 小白的桥段 at 2012-11-21 15:09:08
呃，请问是说我的DNA吗？为什么不行？不纯吗？要达到什么条件才算行呢？...

我感觉你纯化之后应该差不多够建文库的需要，但是纯化前的那个估计不行，因为小片段太多
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11楼2012-11-21 15:40:49
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小白的桥段

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-21 15:40:49
我感觉你纯化之后应该差不多够建文库的需要，但是纯化前的那个估计不行，因为小片段太多...

我附的图是纯化过的DNA，提供的参数也是纯化过后的。跑普通电泳还看不出拖尾，跑脉冲就看出来了。你说的小片段是指条带下面长长的拖尾吧，我也不清楚是电泳过程中的降解还是提取的DNA本身碎片多，这要怎么解决呢？我电泳时间是16小时，胶和缓冲液都灭过菌的。
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12楼2012-11-22 10:35:51
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小白的桥段

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
11楼: Originally posted by jl860822 at 2012-11-21 15:40:49
我感觉你纯化之后应该差不多够建文库的需要，但是纯化前的那个估计不行，因为小片段太多...

再附一张纯化后的DNA图片，从左往有第一个是Lamda Hind3，第二个是1Kb定量marker，第三个是DNA，浓度太高有点跑不动似的，构建文库就是用的这个DNA。

10.29DNA纯化2.5ul.jpg
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13楼2012-11-22 10:55:12
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jl860822

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
13楼: Originally posted by 小白的桥段 at 2012-11-22 10:55:12
再附一张纯化后的DNA图片，从左往有第一个是Lamda Hind3，第二个是1Kb定量marker，第三个是DNA，浓度太高有点跑不动似的，构建文库就是用的这个DNA。

10.29DNA纯化2.5ul.jpg
...

小片段挺多的，但是我看你的这个大片段的分子量挺大的，应该也可以试一下
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14楼2012-11-22 12:59:22
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小白的桥段

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-15 18:44:02
我就做宏基因组学的，构建过十几个Fosmid文库吧

你好，想请教你一下fosmid质粒怎么提取呢？我用3ml的LB摇克隆就是摇不起来呢？不长啊，180rpm也不长，急死了，请指教下吧。谢谢。
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15楼2013-01-07 09:34:43
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beishui

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你建库用的是fosmid试剂盒吧，整体看你的DNA要纯化一下。之后做末端补平。质粒的提取方面，最好还是手提的了，用试剂盒一般很难提取的比较好的
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宠辱不惊，看庭前花开花落；去留无意，望天上云卷云舒。
16楼2013-01-31 11:29:01
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shmilcp

新虫 (初入文坛)
亲，能不能问你一下，你构建的fosmid文库使用提取基因组的量有没有计算过，怎么去测提取的宏基因组文库的浓度
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17楼2014-12-16 14:54:49
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shmilcp

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-15 18:44:02
我就做宏基因组学的，构建过十几个Fosmid文库吧

构建文库的话，需要对提取的宏基因组DNA定量吗，如何测宏基因组的浓度
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18楼2014-12-16 14:56:09
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charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-10-15 18:44:02
我就做宏基因组学的，构建过十几个Fosmid文库吧

您好，我也想做这个文库筛选，但是实验室没有基础，您能否提供相关流程的protocol吗？
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19楼2018-12-04 17:06:07
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