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转化子太多假阳性，怎么办呀？
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我用Nde1和Xho1双酶切pET28a和目的基因，连接转化后验证了15个转化子，都是空载体。1、还要不要继续验证呀？2、我两种酶是同时加的，同步酶切，这样有没有什么问题？3、为何会出现那么多空载体呀，怎么办？ 先谢谢各位大侠啦！ |
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8楼2013-01-04 07:55:53
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【答案】应助回帖
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如果空载体很多，说明酶切有问题才连不上的。我觉得最好不要再验证了，从新酶切连接转化。 首先你要确定两个酶都是工作的。分别单切载体都能完全切开。 我也用NdeI做克隆，第一次也没有出。以我个人的经验，所有这些普通的克隆应该是one shot就差不多的。NdeI活性很强，时间稍长就会切过，酶也不要加多。我觉得你可以先不加NdeI切XhoI, 觉得切开了再加NdeI切20-30分钟就可以了。 |
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