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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)


[交流] 酵母转化假阳性

最近在做毕赤酵母电转。转的是PCR片段,1.7kb,带G418抗性基因。做了很多次,药物板上长了很多,转涂在新的药物板上仍然可以长,但是提基因组做PCR就是没有。阴性对照的板子上没长。
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啊Q精神

木虫 (小有名气)



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amisking: 回帖置顶 2012-08-30 20:11:03
未转化的毕赤酵母在那么大浓度的G418板上长不长?
菌落PCR吗?
可以用煮冻煮的方法处理酵母菌,然后用上清做PCR
5楼2012-08-30 14:00:20
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wujunchina2002

木虫 (初入文坛)


★ ★ ★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流经验 2012-08-31 15:58:34
皇马铁卫: 金币+3 2012-08-31 18:04:36
皇马铁卫: 回帖置顶 2012-08-31 18:04:37
我以前做酵母转化也遇到过和你一模一样的情况。用G418做就是这个样子。那时差不多200个克隆中才有一个是阳性的,其他全是假阳性。后来换用zeocin抗生素就好了,没有假阳性问题。我也试图寻找过用G418时消除假阳性的办法,比如提高抗生素浓度等,但是根本没有用。
12楼2012-08-31 11:24:15
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普通回帖

piaoyunokok

木虫 (正式写手)


★ ★
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皇马铁卫: 金币+1 2012-08-30 16:47:08
会不会是你的G418失效了呀?你添加的浓度是多大呢?
2楼2012-08-30 11:11:49
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
2楼: Originally posted by piaoyunokok at 2012-08-30 11:11:49
会不会是你的G418失效了呀?你添加的浓度是多大呢?

我已经加到300μg/ml。阴性的是没有长啊
3楼2012-08-30 11:37:37
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gwd0312

木虫 (正式写手)


★ ★ ★
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皇马铁卫: 金币+2, 这个有可能 2012-08-31 09:12:44
可能是你提取方法有问题,或者你提取的基因组DNA 浓度过大导致P不出来,最后一种可能就是你的PCR程序有问题!
4楼2012-08-30 11:47:30
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piaoyunokok

木虫 (正式写手)


★ ★
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皇马铁卫: 金币+1 2012-08-31 09:12:56
引用回帖:
3楼: Originally posted by 皇马铁卫 at 2012-08-30 11:37:37
我已经加到300μg/ml。阴性的是没有长啊...

那有可能你的基因组提的效果不是很好,或者PCR不好的。整个过程的影响因素好多的。
6楼2012-08-30 16:05:00
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
4楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-08-30 11:47:30
可能是你提取方法有问题,或者你提取的基因组DNA 浓度过大导致P不出来,最后一种可能就是你的PCR程序有问题!

不是啊,用其他引物可以P出来
7楼2012-08-30 16:48:02
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gwd0312

木虫 (正式写手)


★ ★
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皇马铁卫: 金币+1, 之前已经摸好条件了 2012-08-31 09:13:21
引用回帖:
7楼: Originally posted by 皇马铁卫 at 2012-08-30 16:48:02
不是啊,用其他引物可以P出来...

P的时候做个温度梯度试一下吧!
8楼2012-08-30 17:33:24
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皇马铁卫

铜虫 (正式写手)


引用回帖:
8楼: Originally posted by gwd0312 at 2012-08-30 17:33:24
P的时候做个温度梯度试一下吧!...

阳性对照是有条带的 啊
9楼2012-08-30 18:18:50
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chongju135

木虫 (著名写手)



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用通用引物p,阴性的话也能p出,阳性的p出的条带应该比阴性的大。如果都p不出的话,可能是你提dna的问题,尝试一下用溶壁酶。
10楼2012-08-31 08:36:56
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Nabarro

新虫 (小有名气)


Kit才是王道
11楼2012-08-31 10:25:28
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