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baby1_9253344金虫 (小有名气)
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[求助]
啤酒酵母质粒转化求助
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如题，新生物虫，最近需要转化穿梭质粒入啤酒酵母W303株里，以前从来没做过酵母转化，只做过现成买来的DH5alfa转化... 实验室没有电转化杯，就查了文献（《酵母遗传学方法实验指南》）做化学转化。感觉好像没成功...现在在找原因... 现有以下几点疑问，求教各位过来人： 1，酵母化学转化过程中有哪些关键步骤需要特别注意的？ 2，选择性平板长出来的东西怎么判断是阳性酵母株还是杂菌？一般培养几天能出菌落？ 3，如果有阳性菌落，如何鉴别其成功转入？提质粒跑电泳还是PCR? 4，听说酵母质粒有的提不出来，会被整合，那如何知道我转的质粒是会整合的那种还是可以提出来的那种？我的是P416GPD 谢谢各位耐心读完~~求解~~~ |
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baby1_9253344
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2楼2011-05-13 08:24:45
susizheng
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【答案】应助回帖
baby1_9253344(金币+1): 等你的回答等了好久了，泪奔ing，3Q 2011-05-16 08:35:34
silicare(EPI+1): 2011-05-16 08:41:06
silicare(EPI+1): 2011-05-16 08:41:06
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1，酵母化学转化过程中有哪些关键步骤需要特别注意的？ 只做过电转化，化学转化的话关键步骤肯定是感受态的制备了，由于酵母细胞壁较厚，化学转化比较难，建议用原生质法化。 2，选择性平板长出来的东西怎么判断是阳性酵母株还是杂菌？一般培养几天能出菌落？ 看你是抗生素筛选还是缺陷型筛选了，一般缺陷型筛选比较准确，长出来的基本是阳性，抗生素筛选出假阳性概率要高些。要想判断是否为阳性，都应该提取质粒或者基因组进行验证。酵母比大肠长的慢，2-3d出单菌落。 3，如果有阳性菌落，如何鉴别其成功转入？提质粒跑电泳还是PCR? 看你质粒是负载型的，还是整合型的，负载型的质粒，能提取出来，只是酵母的质粒提取出来浓度会很低，电泳基本看不见，但是做PCR验证还是没有问题的，如果想再做酶切验证，可以发转大肠，再提质粒，再酶切验证。 整合型质粒，只有提取酵母基因组，然后PCR验证。 4，听说酵母质粒有的提不出来，会被整合，那如何知道我转的质粒是会整合的那种还是可以提出来的那种？我的是P416GPD 看是否是负载性的，你找该质粒是否有酵母类型的复制起始位点，比如2u,CEN等。 |
3楼2011-05-15 10:22:51
susizheng
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【答案】应助回帖
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baby1_9253344(金币+3): thanks a lot 2011-05-16 08:33:17
silicare(金币+3): 很热心 2011-05-16 08:41:18
baby1_9253344(金币+3): thanks a lot 2011-05-16 08:33:17
silicare(金币+3): 很热心 2011-05-16 08:41:18
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ATCC® Number: 87360™ Price: $190.00 Designations: p416 GPD Depositors: M Funk Biosafety Level: 1 Vector Information: Size (kb): 5.8039999008178710 Vector: p416 GPD (plasmid) Promoters: Promoter for expression GPD Construction: pRS416 Marker(s):URA3,ampR Construct size (kb): 5.803999900817871 Features: marker(s): URA3 marker(s): ampR promoter for expression: GPD replicon: CEN6/ARSH4 terminator: CYC1 Map Shipped: frozen Permits/Forms: In addition to the MTA mentioned above, other ATCC and/or regulatory permits may be required for the transfer of this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is ultimately responsible for obtaining the permits. Please click here for information regarding the specific requirements for shipment to your location. Applications: YX-type (expression) shuttle vector [45692] vector with low copy number [45692] Comments: Restriction digests of the clone give the following sizes (kb): SstI/XbaI--5.13, 0.68; EcoRI--5.8, BamHI--5.8. Low copy number shuttle expression vector. [45692] Growth Conditions: ATCC medium 1227: LB Medium (ATCC medium 1065) with 50 mcg/ml ampicillin Temperature: 37.0°C Related Products: component of:ATCC 87669 References: 45692: Mumberg D, et al. Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156: 119-122, 1995. PubMed: 7737504 CEN的复制子，低拷贝数，很显然这个质粒是负载型的。 |
4楼2011-05-15 10:32:54
gongeleven
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