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wh7690703

木虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】线性化质粒转化枯草方法

请问各位高手:
BglII线性化质粒,
采用spizizen法和GM法转枯草,
涂LB/红霉素(5或7或10ug/ml)平板筛选,结果:红霉素浓度低的平板大概长30个左右,浓度高的平板长的菌就少,大概10个左右。
鉴定:采用LB/淀粉平板筛选,原理是重组片段插入染色体导致淀粉酶失活。
困惑:至今一个阳性克隆都筛不到。
求助:1.请问还有别的转化方法吗?比如Molecular method for Bacillus specise中的方法。
2.线性化位点可以随便选择吗?BamHI可以用吗?
我应该如何改进啊?
兄弟姐妹们不要吝啬你的知识啊,帮帮小弟吧

[ Last edited by wh7690703 on 2011-4-20 at 15:12 ]
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ls2046

铁杆木虫 (职业作家)


★ ★ ★ ★
wh7690703(金币+2):谢谢参与
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流,欢迎常来 2011-03-22 13:33:38
线性化应该没有问题的。能够拿到转化子说明感受应该不是主要问题。可能是定向插入有问题吧,建议看看基因插入的同源臂有没有问题,再就是多做几次转化,多拿些转化子,有时候几率还是很重要的,呵呵
2楼2011-03-22 10:53:21
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wh7690703

木虫 (正式写手)


那么,如何提高定向插入呢?
3楼2011-03-22 15:24:16
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wh7690703

木虫 (正式写手)


高手帮助啊
4楼2011-03-24 21:56:21
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wh7690703

木虫 (正式写手)


高手帮助啊
5楼2011-03-25 08:32:12
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wh7690703

木虫 (正式写手)


高手帮助啊
6楼2011-03-25 17:41:08
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wh7690703

木虫 (正式写手)


求助:1.请问还有别的转化方法吗?比如Molecular method for Bacillus specise中的方法。
2.线性化位点可以随便选择吗?BamHI可以用吗?
7楼2011-04-20 15:13:15
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wh7690703

木虫 (正式写手)


高手帮助啊
8楼2011-04-27 15:02:31
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