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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】线性化质粒转化枯草方法
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wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】线性化质粒转化枯草方法

请问各位高手：
BglII线性化质粒，
采用spizizen法和GM法转枯草，
涂LB/红霉素（5或7或10ug/ml）平板筛选，结果：红霉素浓度低的平板大概长30个左右，浓度高的平板长的菌就少，大概10个左右。
鉴定：采用LB/淀粉平板筛选，原理是重组片段插入染色体导致淀粉酶失活。
困惑：至今一个阳性克隆都筛不到。
求助：1.请问还有别的转化方法吗？比如Molecular method for Bacillus specise中的方法。
2.线性化位点可以随便选择吗？BamHI可以用吗？
我应该如何改进啊？
兄弟姐妹们不要吝啬你的知识啊，帮帮小弟吧

[ Last edited by wh7690703 on 2011-4-20 at 15:12 ]
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1楼 2011-03-22 10:29:23
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wh7690703

木虫 (正式写手)
求助：1.请问还有别的转化方法吗？比如Molecular method for Bacillus specise中的方法。
2.线性化位点可以随便选择吗？BamHI可以用吗？
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7楼2011-04-20 15:13:15
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ls2046

铁杆木虫 (职业作家)
★ ★ ★ ★
wh7690703(金币+2):谢谢参与
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-03-22 13:33:38
线性化应该没有问题的。能够拿到转化子说明感受应该不是主要问题。可能是定向插入有问题吧，建议看看基因插入的同源臂有没有问题，再就是多做几次转化，多拿些转化子，有时候几率还是很重要的，呵呵
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2011-03-22 10:53:21
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wh7690703

木虫 (正式写手)
那么，如何提高定向插入呢？
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3楼2011-03-22 15:24:16
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