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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分离酵母质粒
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xuanmu0929

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】分离酵母质粒

我从酵母中提取两种质粒，用试剂盒提的，PCR鉴定两种质粒均提出来了，它们具有不同抗性，因为想测序，所以把质粒转入大肠杆菌，寻找只有一种抗性的菌株然后去测序，可是一直转不进去，不知有没有更好的方法

[ Last edited by xuanmu0929 on 2011-1-10 at 08:50 ]
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1楼 2011-01-10 08:44:43
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real339

金虫 (正式写手)
xuanmu0929(金币+1): 2011-01-10 10:50:50
转入大肠杆菌？是能在大肠杆菌复制的质粒吗？
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2楼2011-01-10 09:55:23
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zx1984

木虫 (正式写手)
xuanmu0929(金币+1): 2011-01-10 10:50:42
质粒的量是多少?是不是太多了
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3楼2011-01-10 10:08:08
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xuanmu0929

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by real339 at 2011-01-10 09:55:23:
转入大肠杆菌？是能在大肠杆菌复制的质粒吗？

是的，转超级菌，培养好几天，只长出很小的菌落，挑单克隆置于相应抗性的培养基中却不生长，不知有其他的分离法方法吗？谢谢
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4楼2011-01-10 10:50:11
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xuanmu0929

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by zx1984 at 2011-01-10 10:08:08:
质粒的量是多少?是不是太多了

不多呀，浓度才50呀，挺低的
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5楼2011-01-10 10:52:07
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srlee

铁杆木虫 (小有名气)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-10 12:05:53
xuanmu0929(金币+1): 2011-01-10 13:40:34
同意二楼的观点，质粒用的是穿梭载体吗？如果是应该没有问题的！
另你要送测序，只要量足够，给点引物直接送就行了呀，为什么还要转进E.coli呢？
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6楼2011-01-10 11:16:52
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real339

金虫 (正式写手)
★ ★
silicare(金币+2):这种可能性最大 2011-01-10 11:41:03
xuanmu0929(金币+1): 2011-01-11 08:56:51
培养好多天才长出一点，应该不是你要的菌，这可能是杂菌。大肠杆菌长的很快的。十几个小时就够了。
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7楼2011-01-10 11:18:39
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real339

金虫 (正式写手)
★ ★
silicare(金币+2):分析的很透彻 2011-01-10 11:41:24
xuanmu0929(金币+1): 2011-01-11 08:56:58
还有就是你的质粒的抗性基因是不是有原核的启动子啊？
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8楼2011-01-10 11:19:30
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real339

金虫 (正式写手)
建议通过梯度的抗生素浓度选择合适的筛选压。然后再分析是不是载体的原因，看能不能在原核细胞内表达吧。
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9楼2011-01-10 11:21:49
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xuanmu0929

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by srlee at 2011-01-10 11:16:52:
同意二楼的观点，质粒用的是穿梭载体吗？如果是应该没有问题的！
另你要送测序，只要量足够，给点引物直接送就行了呀，为什么还要转进E.coli呢？

是穿梭质粒，质粒浓度太低了，只有50ng/ul，估计测序测不出来
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10楼2011-01-10 13:40:05
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susizheng

木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by xuanmu0929 at 2011-01-10 13:40:05:

是穿梭质粒，质粒浓度太低了，只有50ng/ul，估计测序测不出来

50ng/ul，不低了，符合测序要求。
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11楼2011-01-10 15:32:31
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xuanmu0929

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2011-01-10 15:32:31:

50ng/ul，不低了，符合测序要求。

呵呵，谢谢你！非常感谢
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12楼2011-01-10 16:08:59
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tdhslxiaoyao

新虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
147359楼: Originally posted by xuanmu0929 at 2011-01-10 16:08:59:
呵呵，谢谢你！非常感谢

你好，我在做提取质粒，我的是单拷贝质粒，而且比较大，有十几KB，请问你用的是什么试剂盒呀？你的有多大？谢谢
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13楼2012-05-15 00:00:30
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